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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接不成功，跪求指导！
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爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接不成功，跪求指导！ 已有4人参与

最近在做构建，但是连接连了很久都没连上，一端是平末端，一段是粘性末端，没别的位点可以选了，只能用这个。用的Takara的T4连接酶，连接是按摩尔比加的，1：3，1：5，1：10都用过，还加了PEG4000，4°、16°过夜都试过，平板上会有很多菌落，但是菌落PCR一直都没有条带，应该都试载体自连，片段3000bp，载体4900bp。哪位大神做过类似的，麻烦支支招吧，愁死了！
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1楼 2013-12-09 22:40:56
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:32
引用回帖:
7楼: Originally posted by 爱吃小苹果 at 2013-12-10 09:39:30
是PCR产物回收后再做的酶切，目的片段和载体都是双酶切，是fermentas的快切，切了8h，载体没有去磷酸化过，下面打算试一下。至于酶切是否完全，没有方法检测，所以也没法判断。...

目的片段是否酶切完全很不好说，以为大小几乎没有变化。而且位点靠近片段末端，切割效率会下降。通常不用快切，用普通酶切过夜。载体是否切完全是可以看的。只需按照同样的体系建立单酶切对照，跑电泳检测是否完全切成一条线性分子。
连不同的粘性末端一般不用去磷酸化，平末端去磷酸化。由于你有很多自连，我怀疑酶切效果不是很好，至少可以控制把载体片段切完全。
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18楼2013-12-10 15:18:39
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aoda123

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:39:11
以前看过一文章说，把酶切处理过的载体和目的片段按比例混合，65度加热5min，然后把温度降到16度，加入连接酶。
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身体健康，工作顺利
22楼2013-12-10 20:34:18
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普通回帖

weishengsu5

木虫 (正式写手)
这个貌似有点大

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2楼2013-12-09 22:43:51
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-09 23:37:00
假阳性太多了，可能是载体自连了，所以菌液PCR 什么都没有，很难挑到真阳性。你用什么酶切的，在做连接体系的时候，按1.6%加内切酶在连接反应体系里，连接反应完成后，在37度中让内切酶反应半小时，把自连的载体切开，这样就减少了自连的假阳性。后面在做就能简单点，我也和你一样，现在假阳性是解决了菌液PCR 阳性也很正常，但提了质粒又不对

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3楼2013-12-09 22:52:47
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

T 4不是22度吗，四度，十六度不对吧

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4楼2013-12-09 22:54:30
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体自连，你取多少载体进行双酶切的呢？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2013-12-09 23:37:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:05:55
目的片段是PCR产物纯化后再做的酶切？
你的目的片段用的是双酶切，还是只用了粘性末端酶切的？
确定两个酶都酶切完全，把载体片段去磷酸化。
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6楼2013-12-10 05:36:09
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爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-10 05:36:09
目的片段是PCR产物纯化后再做的酶切？
你的目的片段用的是双酶切，还是只用了粘性末端酶切的？
确定两个酶都酶切完全，把载体片段去磷酸化。

是PCR产物回收后再做的酶切，目的片段和载体都是双酶切，是fermentas的快切，切了8h，载体没有去磷酸化过，下面打算试一下。至于酶切是否完全，没有方法检测，所以也没法判断。
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7楼2013-12-10 09:39:30
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爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-09 23:37:46
载体自连，你取多少载体进行双酶切的呢？

载体的量是30ng，然后片段根据比例1:3,1:5,1:10都做过
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8楼2013-12-10 09:40:39
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爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by zhang宇微 at 2013-12-09 22:54:30
T 4不是22度吗，四度，十六度不对吧

生工的T4我用过，说明书是22°，takara的说明书应该是16度
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9楼2013-12-10 09:41:32
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爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhang宇微 at 2013-12-09 22:52:47
假阳性太多了，可能是载体自连了，所以菌液PCR 什么都没有，很难挑到真阳性。你用什么酶切的，在做连接体系的时候，按1.6%加内切酶在连接反应体系里，连接反应完成后，在37度中让内切酶反应半小时，把自连的载体切开 ...

37度让内切酶反应半小时不会把连好的给切开吗？你是PCR回收后直接和载体相连的吗？
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10楼2013-12-10 09:44:51
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