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zhang宇微

金虫 (正式写手)

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引用回帖:

15楼: Originally posted by happy361 at 2013-12-10 13:44:40
不同公司的T4酶连接温度不同。...

哦哦这样

[ 发自小木虫客户端 ]

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21楼2013-12-10 18:37:47

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aoda123

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:39:11

以前看过一文章说，把酶切处理过的载体和目的片段按比例混合，65度加热5min，然后把温度降到16度，加入连接酶。

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身体健康，工作顺利

22楼2013-12-10 20:34:18

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achillesyao

铜虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:53

目的片段有3000bp，可以把摩尔比调大一点，你这种情况第一要确定抗生素100%没有失效，是不是抗生素配的时间太久。第二是否双酶切？双酶切不需要去磷酸化。很有可能是你双酶切效率太低。造成的原因有很多，你的保护碱基、内切酶的效率和种类、酶切是否彻底（我一般选好切的酶过夜酶切）、酶切的时间还有纯化时是否干净等等。都排除之后就是连接酶的问题，T4连接酶能提供的吉布斯自由能不酸太高，可能达不到你的反应要求（你的片段是3000bp），可以选用Takara的Solution 1连接酶。不贵，好像是80元-100元。放在16度4h或4度过夜。

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23楼2013-12-11 10:37:28

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