应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接不成功，跪求指导！
273/3返回列表上一页123
查看: 2798  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zhang宇微

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by happy361 at 2013-12-10 13:44:40
不同公司的T4酶连接温度不同。...

哦哦这样

[ 发自小木虫客户端 ]
回复此楼
21楼2013-12-10 18:37:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aoda123

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:39:11
以前看过一文章说，把酶切处理过的载体和目的片段按比例混合，65度加热5min，然后把温度降到16度，加入连接酶。
赞一下(1人) 回复此楼
身体健康，工作顺利
22楼2013-12-10 20:34:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

achillesyao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:53
目的片段有3000bp，可以把摩尔比调大一点，你这种情况第一要确定抗生素100%没有失效，是不是抗生素配的时间太久。第二是否双酶切？双酶切不需要去磷酸化。很有可能是你双酶切效率太低。造成的原因有很多，你的保护碱基、内切酶的效率和种类、酶切是否彻底（我一般选好切的酶过夜酶切）、酶切的时间还有纯化时是否干净等等。都排除之后就是连接酶的问题，T4连接酶能提供的吉布斯自由能不酸太高，可能达不到你的反应要求（你的片段是3000bp），可以选用Takara的Solution 1连接酶。不贵，好像是80元-100元。放在16度4h或4度过夜。
赞一下 回复此楼
23楼2013-12-11 10:37:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-12-28 21:06:59
我用的是NEB的T4酶，室温连接2-4小时就好了。前提是载体和片段一定要处理干净，我总是用胶回收法回收载体，以防有没有切干净的载体干扰最终结果。
一平一粘根本不需要磷酸酶处理。
连接比例一般是1:3-1:6，最多不要超过1:8，载体和片段比例计算时一定不要弄反。
赞一下 回复此楼
24楼2013-12-11 18:33:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zijinok

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:07:06
载体的自连很多，可以考虑对双切之后的载体做一个脱磷酸化，然后再连接，可以很好的降低自连……但平末端和粘性末端混合这种，没做过……
赞一下 回复此楼
25楼2013-12-28 15:12:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

木vs木

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

连接不是37度过夜吗？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
坚持就是胜利！
26楼2013-12-29 01:48:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fei0322

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是??是酶加少了？平末端应该需??更大的酶?????。

[ ????С??????? ]
赞一下 回复此楼
27楼2013-12-29 19:36:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 爱吃小苹果 的主题更新
273/3返回列表上一页123
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 3/150 2026-11-10 01:40 by FChKX8meu1ds
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 4/200 2026-11-10 01:29 by FChKX8meu1ds
[考博] 27博士申请 +3 白白白ly 2026-11-09 3/150 2026-11-09 21:39 by szq0819
[文学芳草园] 厉娜 +3 张丹枫1991 2026-11-09 5/250 2026-11-09 16:53 by 张丹枫1991
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 12/600 2026-11-09 13:26 by Equinoxhua
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +6 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 14/700 2026-11-09 11:52 by GwrQVVR6Oenx
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 15/750 2026-11-09 11:41 by GwrQVVR6Oenx
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 10/500 2026-11-09 08:00 by IhnEQauGmT3K
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 12/600 2026-11-09 06:32 by l48hFd8Nwae2
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-09 00:14 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-08 23:01 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 9/450 2026-11-08 22:46 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容 +3 yexuqing 2026-11-04 5/250 2026-11-07 13:22 by 苏东坡二世
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:02 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 hNpp4Y2CGvSC 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:53 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭