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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接不成功，跪求指导！
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zhang宇微

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by happy361 at 2013-12-10 13:44:40
不同公司的T4酶连接温度不同。...

哦哦这样

[ 发自小木虫客户端 ]
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21楼2013-12-10 18:37:47
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aoda123

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:39:11
以前看过一文章说，把酶切处理过的载体和目的片段按比例混合，65度加热5min，然后把温度降到16度，加入连接酶。
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身体健康，工作顺利
22楼2013-12-10 20:34:18
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achillesyao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:53
目的片段有3000bp，可以把摩尔比调大一点，你这种情况第一要确定抗生素100%没有失效，是不是抗生素配的时间太久。第二是否双酶切？双酶切不需要去磷酸化。很有可能是你双酶切效率太低。造成的原因有很多，你的保护碱基、内切酶的效率和种类、酶切是否彻底（我一般选好切的酶过夜酶切）、酶切的时间还有纯化时是否干净等等。都排除之后就是连接酶的问题，T4连接酶能提供的吉布斯自由能不酸太高，可能达不到你的反应要求（你的片段是3000bp），可以选用Takara的Solution 1连接酶。不贵，好像是80元-100元。放在16度4h或4度过夜。
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23楼2013-12-11 10:37:28
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doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-12-28 21:06:59
我用的是NEB的T4酶，室温连接2-4小时就好了。前提是载体和片段一定要处理干净，我总是用胶回收法回收载体，以防有没有切干净的载体干扰最终结果。
一平一粘根本不需要磷酸酶处理。
连接比例一般是1:3-1:6，最多不要超过1:8，载体和片段比例计算时一定不要弄反。
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24楼2013-12-11 18:33:38
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zijinok

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:07:06
载体的自连很多，可以考虑对双切之后的载体做一个脱磷酸化，然后再连接，可以很好的降低自连……但平末端和粘性末端混合这种，没做过……
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25楼2013-12-28 15:12:46
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木vs木

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

连接不是37度过夜吗？

[ 发自小木虫客户端 ]
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坚持就是胜利！
26楼2013-12-29 01:48:29
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fei0322

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是??是酶加少了？平末端应该需??更大的酶?????。

[ ????С??????? ]
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27楼2013-12-29 19:36:26
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