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连接不成功，跪求指导！ 已有4人参与
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| 最近在做构建，但是连接连了很久都没连上，一端是平末端，一段是粘性末端，没别的位点可以选了，只能用这个。用的Takara的T4连接酶，连接是按摩尔比加的，1：3，1：5，1：10都用过，还加了PEG4000，4°、16°过夜都试过，平板上会有很多菌落，但是菌落PCR一直都没有条带，应该都试载体自连，片段3000bp，载体4900bp。哪位大神做过类似的，麻烦支支招吧，愁死了！ |
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achillesyao
铜虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:53
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:53
| 目的片段有3000bp，可以把摩尔比调大一点，你这种情况第一要确定抗生素100%没有失效，是不是抗生素配的时间太久。第二是否双酶切？双酶切不需要去磷酸化。很有可能是你双酶切效率太低。造成的原因有很多，你的保护碱基、内切酶的效率和种类、酶切是否彻底（我一般选好切的酶过夜酶切）、酶切的时间还有纯化时是否干净等等。都排除之后就是连接酶的问题，T4连接酶能提供的吉布斯自由能不酸太高，可能达不到你的反应要求（你的片段是3000bp），可以选用Takara的Solution 1连接酶。不贵，好像是80元-100元。放在16度4h或4度过夜。 |
23楼2013-12-11 10:37:28
weishengsu5
木虫 (正式写手)
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2楼2013-12-09 22:43:51
3楼2013-12-09 22:52:47
4楼2013-12-09 22:54:30