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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接不成功，跪求指导！
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爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by weishengsu5 at 2013-12-09 22:43:51
这个貌似有点大

是片段大吗？
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11楼2013-12-10 09:45:15
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:09
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10楼: Originally posted by 爱吃小苹果 at 2013-12-10 09:44:51
37度让内切酶反应半小时不会把连好的给切开吗？你是PCR回收后直接和载体相连的吗？...

是的，但载体要用酶切一下，然后切胶回收片段，和目的基因连接。只会把自连的切开，连接好的好像也会切开，但需要的时间长，所以这个切的时间还得你自己摸，最少十五分钟吧，我做了一次，菌液PCR 的结果挺好的。实验就是要慢慢摸索，试验的，别灰心加油

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12楼2013-12-10 12:49:21
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爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zhang宇微 at 2013-12-10 12:49:21
是的，但载体要用酶切一下，然后切胶回收片段，和目的基因连接。只会把自连的切开，连接好的好像也会切开，但需要的时间长，所以这个切的时间还得你自己摸，最少十五分钟吧，我做了一次，菌液PCR 的结果挺好的。实 ...

好的，非常感谢！
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13楼2013-12-10 13:01:09
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huahu3600

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:15
连接不成功80%是酶切的问题，特别是双酶切，很容易酶切不完全。
连接体系，载体要少，片段要多。
连接时间可以很短（只要酶切完全，很容易连接的），一般1小时足够。
菌落PCR不靠谱啊不靠谱
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14楼2013-12-10 13:03:34
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happy361

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhang宇微 at 2013-12-09 22:54:30
T 4不是22度吗，四度，十六度不对吧

不同公司的T4酶连接温度不同。
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15楼2013-12-10 13:44:40
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

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8楼: Originally posted by 爱吃小苹果 at 2013-12-10 09:40:39
载体的量是30ng，然后片段根据比例1:3,1:5,1:10都做过...

你酶切了多少载体，不是用了多少载体进行连接？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
16楼2013-12-10 15:01:10
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小小坤宝

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:25
你可以试试将载体抽提质量提高，并且采用过夜酶切，保证酶切干净，再做连接可能会好点的。
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17楼2013-12-10 15:16:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:32
引用回帖:
7楼: Originally posted by 爱吃小苹果 at 2013-12-10 09:39:30
是PCR产物回收后再做的酶切，目的片段和载体都是双酶切，是fermentas的快切，切了8h，载体没有去磷酸化过，下面打算试一下。至于酶切是否完全，没有方法检测，所以也没法判断。...

目的片段是否酶切完全很不好说，以为大小几乎没有变化。而且位点靠近片段末端，切割效率会下降。通常不用快切，用普通酶切过夜。载体是否切完全是可以看的。只需按照同样的体系建立单酶切对照，跑电泳检测是否完全切成一条线性分子。
连不同的粘性末端一般不用去磷酸化，平末端去磷酸化。由于你有很多自连，我怀疑酶切效果不是很好，至少可以控制把载体片段切完全。
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18楼2013-12-10 15:18:39
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:40
引用回帖:
7楼: Originally posted by 爱吃小苹果 at 2013-12-10 09:39:30
是PCR产物回收后再做的酶切，目的片段和载体都是双酶切，是fermentas的快切，切了8h，载体没有去磷酸化过，下面打算试一下。至于酶切是否完全，没有方法检测，所以也没法判断。...

酶切完全是否可以检测的，你将酶切回收的载体直接转化，如果长很多斑就是没切开啊，连接成功的关键就是酶切完全~~~这步非常关键
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19楼2013-12-10 15:59:57
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孤城一片

木虫 (小有名气)
同样的问题，结果一致的假阳性，现在又在重复中。。。
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本意探花郎，奈何芷若香；寄意予青陆，共沐好蟾光。
20楼2013-12-10 16:05:48
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