应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接不成功，跪求指导！
272/3返回列表上一页123下一页
查看: 2805  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by weishengsu5 at 2013-12-09 22:43:51
这个貌似有点大

是片段大吗？
回复此楼
11楼2013-12-10 09:45:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:09
引用回帖:
10楼: Originally posted by 爱吃小苹果 at 2013-12-10 09:44:51
37度让内切酶反应半小时不会把连好的给切开吗？你是PCR回收后直接和载体相连的吗？...

是的，但载体要用酶切一下，然后切胶回收片段，和目的基因连接。只会把自连的切开，连接好的好像也会切开，但需要的时间长，所以这个切的时间还得你自己摸，最少十五分钟吧，我做了一次，菌液PCR 的结果挺好的。实验就是要慢慢摸索，试验的，别灰心加油

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
12楼2013-12-10 12:49:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zhang宇微 at 2013-12-10 12:49:21
是的，但载体要用酶切一下，然后切胶回收片段，和目的基因连接。只会把自连的切开，连接好的好像也会切开，但需要的时间长，所以这个切的时间还得你自己摸，最少十五分钟吧，我做了一次，菌液PCR 的结果挺好的。实 ...

好的，非常感谢！
回复此楼
13楼2013-12-10 13:01:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huahu3600

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:15
连接不成功80%是酶切的问题，特别是双酶切，很容易酶切不完全。
连接体系，载体要少，片段要多。
连接时间可以很短（只要酶切完全，很容易连接的），一般1小时足够。
菌落PCR不靠谱啊不靠谱
赞一下 回复此楼
14楼2013-12-10 13:03:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happy361

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhang宇微 at 2013-12-09 22:54:30
T 4不是22度吗，四度，十六度不对吧

不同公司的T4酶连接温度不同。
赞一下 回复此楼
15楼2013-12-10 13:44:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 爱吃小苹果 at 2013-12-10 09:40:39
载体的量是30ng，然后片段根据比例1:3,1:5,1:10都做过...

你酶切了多少载体，不是用了多少载体进行连接？
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
16楼2013-12-10 15:01:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小小坤宝

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:25
你可以试试将载体抽提质量提高，并且采用过夜酶切，保证酶切干净，再做连接可能会好点的。
赞一下 回复此楼
17楼2013-12-10 15:16:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:32
引用回帖:
7楼: Originally posted by 爱吃小苹果 at 2013-12-10 09:39:30
是PCR产物回收后再做的酶切，目的片段和载体都是双酶切，是fermentas的快切，切了8h，载体没有去磷酸化过，下面打算试一下。至于酶切是否完全，没有方法检测，所以也没法判断。...

目的片段是否酶切完全很不好说，以为大小几乎没有变化。而且位点靠近片段末端，切割效率会下降。通常不用快切，用普通酶切过夜。载体是否切完全是可以看的。只需按照同样的体系建立单酶切对照，跑电泳检测是否完全切成一条线性分子。
连不同的粘性末端一般不用去磷酸化，平末端去磷酸化。由于你有很多自连，我怀疑酶切效果不是很好，至少可以控制把载体片段切完全。
赞一下(1人) 回复此楼
18楼2013-12-10 15:18:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 21:06:40
引用回帖:
7楼: Originally posted by 爱吃小苹果 at 2013-12-10 09:39:30
是PCR产物回收后再做的酶切，目的片段和载体都是双酶切，是fermentas的快切，切了8h，载体没有去磷酸化过，下面打算试一下。至于酶切是否完全，没有方法检测，所以也没法判断。...

酶切完全是否可以检测的，你将酶切回收的载体直接转化，如果长很多斑就是没切开啊，连接成功的关键就是酶切完全~~~这步非常关键
赞一下 回复此楼
19楼2013-12-10 15:59:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

孤城一片

木虫 (小有名气)
同样的问题，结果一致的假阳性，现在又在重复中。。。
赞一下 回复此楼
本意探花郎，奈何芷若香；寄意予青陆，共沐好蟾光。
20楼2013-12-10 16:05:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 爱吃小苹果 的主题更新
272/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 4/200 2026-11-10 19:50 by Z7qfCsdIiD1T
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 5/250 2026-11-10 19:45 by Z7qfCsdIiD1T
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 4/200 2026-11-10 19:39 by Z7qfCsdIiD1T
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 12:52 by C6CRn66RYYXS
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 12:19 by C6CRn66RYYXS
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 11:35 by YHiw1gou1Eda
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 4/200 2026-11-10 11:02 by YHiw1gou1Eda
[文学芳草园] 厉娜 +3 张丹枫1991 2026-11-09 5/250 2026-11-09 16:53 by 张丹枫1991
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 10/500 2026-11-09 08:00 by IhnEQauGmT3K
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 12/600 2026-11-09 06:32 by l48hFd8Nwae2
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-09 00:14 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-08 23:01 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 9/450 2026-11-08 22:46 by l48hFd8Nwae2
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 12/600 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:02 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 hNpp4Y2CGvSC 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:53 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭