应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接不成功，跪求指导！
51/1返回列表
查看: 1988  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接不成功，跪求指导！ 已有4人参与

最近在做构建，但是连接连了很久都没连上，一端是平末端，一段是粘性末端，没别的位点可以选了，只能用这个。用的Takara的T4连接酶，连接是按摩尔比加的，1：3，1：5，1：10都用过，还加了PEG4000，4°、16°过夜都试过，平板上会有很多菌落，但是菌落PCR一直都没有条带，应该都试载体自连，片段3000bp，载体4900bp。哪位大神做过类似的，麻烦支支招吧，愁死了！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-12-09 22:40:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhang宇微 at 2013-12-09 22:52:47
假阳性太多了，可能是载体自连了，所以菌液PCR 什么都没有，很难挑到真阳性。你用什么酶切的，在做连接体系的时候，按1.6%加内切酶在连接反应体系里，连接反应完成后，在37度中让内切酶反应半小时，把自连的载体切开 ...

37度让内切酶反应半小时不会把连好的给切开吗？你是PCR回收后直接和载体相连的吗？
赞一下 回复此楼
10楼2013-12-10 09:44:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 27 个回答

weishengsu5

木虫 (正式写手)
这个貌似有点大

[ 发自小木虫客户端 ]
回复此楼
2楼2013-12-09 22:43:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-09 23:37:00
假阳性太多了，可能是载体自连了，所以菌液PCR 什么都没有，很难挑到真阳性。你用什么酶切的，在做连接体系的时候，按1.6%加内切酶在连接反应体系里，连接反应完成后，在37度中让内切酶反应半小时，把自连的载体切开，这样就减少了自连的假阳性。后面在做就能简单点，我也和你一样，现在假阳性是解决了菌液PCR 阳性也很正常，但提了质粒又不对

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
3楼2013-12-09 22:52:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

T 4不是22度吗，四度，十六度不对吧

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-09 22:54:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 27 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭