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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接不成功，跪求指导！
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爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接不成功，跪求指导！ 已有4人参与

最近在做构建，但是连接连了很久都没连上，一端是平末端，一段是粘性末端，没别的位点可以选了，只能用这个。用的Takara的T4连接酶，连接是按摩尔比加的，1：3，1：5，1：10都用过，还加了PEG4000，4°、16°过夜都试过，平板上会有很多菌落，但是菌落PCR一直都没有条带，应该都试载体自连，片段3000bp，载体4900bp。哪位大神做过类似的，麻烦支支招吧，愁死了！
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1楼 2013-12-09 22:40:56
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爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-10 05:36:09
目的片段是PCR产物纯化后再做的酶切？
你的目的片段用的是双酶切，还是只用了粘性末端酶切的？
确定两个酶都酶切完全，把载体片段去磷酸化。

是PCR产物回收后再做的酶切，目的片段和载体都是双酶切，是fermentas的快切，切了8h，载体没有去磷酸化过，下面打算试一下。至于酶切是否完全，没有方法检测，所以也没法判断。
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7楼2013-12-10 09:39:30
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weishengsu5

木虫 (正式写手)
这个貌似有点大

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2楼2013-12-09 22:43:51
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-09 23:37:00
假阳性太多了，可能是载体自连了，所以菌液PCR 什么都没有，很难挑到真阳性。你用什么酶切的，在做连接体系的时候，按1.6%加内切酶在连接反应体系里，连接反应完成后，在37度中让内切酶反应半小时，把自连的载体切开，这样就减少了自连的假阳性。后面在做就能简单点，我也和你一样，现在假阳性是解决了菌液PCR 阳性也很正常，但提了质粒又不对

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3楼2013-12-09 22:52:47
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

T 4不是22度吗，四度，十六度不对吧

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4楼2013-12-09 22:54:30
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