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汕头大学海洋科学接受调剂
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爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接不成功,跪求指导! 已有4人参与

最近在做构建,但是连接连了很久都没连上,一端是平末端,一段是粘性末端,没别的位点可以选了,只能用这个。用的Takara的T4连接酶,连接是按摩尔比加的,1:3,1:5,1:10都用过,还加了PEG4000,4°、16°过夜都试过,平板上会有很多菌落,但是菌落PCR一直都没有条带,应该都试载体自连,片段3000bp,载体4900bp。哪位大神做过类似的,麻烦支支招吧,愁死了!
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爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-10 05:36:09
目的片段是PCR产物纯化后再做的酶切?
你的目的片段用的是双酶切,还是只用了粘性末端酶切的?
确定两个酶都酶切完全,把载体片段去磷酸化。

是PCR产物回收后再做的酶切,目的片段和载体都是双酶切,是fermentas的快切,切了8h,载体没有去磷酸化过,下面打算试一下。至于酶切是否完全,没有方法检测,所以也没法判断。
7楼2013-12-10 09:39:30
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weishengsu5

木虫 (正式写手)

这个貌似有点大

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2013-12-09 22:43:51
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-09 23:37:00
假阳性太多了,可能是载体自连了,所以菌液PCR 什么都没有,很难挑到真阳性。你用什么酶切的,在做连接体系的时候,按1.6%加内切酶在连接反应体系里,连接反应完成后,在37度中让内切酶反应半小时,把自连的载体切开,这样就减少了自连的假阳性。后面在做就能简单点,我也和你一样,现在假阳性是解决了菌液PCR 阳性也很正常,但提了质粒又不对

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2013-12-09 22:52:47
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

T 4不是22度吗,四度,十六度不对吧

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2013-12-09 22:54:30
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