应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接不成功，跪求指导！
51/1返回列表
查看: 2806  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接不成功，跪求指导！ 已有4人参与

最近在做构建，但是连接连了很久都没连上，一端是平末端，一段是粘性末端，没别的位点可以选了，只能用这个。用的Takara的T4连接酶，连接是按摩尔比加的，1：3，1：5，1：10都用过，还加了PEG4000，4°、16°过夜都试过，平板上会有很多菌落，但是菌落PCR一直都没有条带，应该都试载体自连，片段3000bp，载体4900bp。哪位大神做过类似的，麻烦支支招吧，愁死了！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-12-09 22:40:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

爱吃小苹果

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhang宇微 at 2013-12-09 22:54:30
T 4不是22度吗，四度，十六度不对吧

生工的T4我用过，说明书是22°，takara的说明书应该是16度
赞一下 回复此楼
9楼2013-12-10 09:41:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 27 个回答

weishengsu5

木虫 (正式写手)
这个貌似有点大

[ 发自小木虫客户端 ]
回复此楼
2楼2013-12-09 22:43:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-09 23:37:00
假阳性太多了，可能是载体自连了，所以菌液PCR 什么都没有，很难挑到真阳性。你用什么酶切的，在做连接体系的时候，按1.6%加内切酶在连接反应体系里，连接反应完成后，在37度中让内切酶反应半小时，把自连的载体切开，这样就减少了自连的假阳性。后面在做就能简单点，我也和你一样，现在假阳性是解决了菌液PCR 阳性也很正常，但提了质粒又不对

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
3楼2013-12-09 22:52:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

T 4不是22度吗，四度，十六度不对吧

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-09 22:54:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 27 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 4/200 2026-11-10 19:39 by Z7qfCsdIiD1T
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 4/200 2026-11-10 19:17 by czAiolzR0IJC
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 3/150 2026-11-10 16:43 by G2rhSvqvhNzl
[考博] 申请环境，微生物方向博士 +3 浅笑09 2026-11-08 3/150 2026-11-10 12:44 by 可淡不可忘
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 12:30 by C6CRn66RYYXS
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 12:19 by C6CRn66RYYXS
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 11:46 by YHiw1gou1Eda
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 11:35 by YHiw1gou1Eda
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容 +4 yexuqing 2026-11-04 6/300 2026-11-10 11:13 by susizheng
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 5/250 2026-11-10 09:23 by 1yv6QACPoY1E
[考博] 27博士申请 +3 白白白ly 2026-11-09 3/150 2026-11-09 21:39 by szq0819
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 12/600 2026-11-09 13:26 by Equinoxhua
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 15/750 2026-11-09 11:41 by GwrQVVR6Oenx
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 10/500 2026-11-09 08:00 by IhnEQauGmT3K
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-08 23:01 by l48hFd8Nwae2
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 12/600 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 hNpp4Y2CGvSC 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:53 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭