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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌落PCR有杂带
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR有杂带已有5人参与

各位大虾，下面是我菌落PCR电泳检测的结果，主带是我的目的条带，但是这次PCR结果基本都有较明显的杂带，是我PCR操作的问题，还是其他什么原因呢？还有就是这样的菌液送测序，结果不好吗？

菌落PCR有杂带
2014.4.15-18s.png
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越努力越幸运
1楼2014-04-15 17:57:44
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是退火温度低了？

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-04-15 18:21:56
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-04-15 20:50:34
非特异性片段，有时提高退火温度会有作用。。。
还有，可能污染杂菌。。。
另外，需要正对照，这样可以比较。。。
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3楼2014-04-15 18:35:15
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David勇

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-04-15 20:50:40
用的引物是通用引物吗？是不是挑克隆的时候无然杂菌，或者不是单克隆，有很多原因的，退火温度也可以高点试下。以前有没有做出过没有杂带的情况？
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4楼2014-04-15 19:56:52
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-15 18:21:56
是不是退火温度低了？

退火温度跟平时做PCR时一样的，您的意思是这只是单纯的非特异性扩增？
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越努力越幸运
5楼2014-04-15 21:09:46
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by David勇 at 2014-04-15 19:56:52
用的引物是通用引物吗？是不是挑克隆的时候无然杂菌，或者不是单克隆，有很多原因的，退火温度也可以高点试下。以前有没有做出过没有杂带的情况？

是用的我自己的特异性引物，以前做出来的会有一些拖带的情况
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越努力越幸运
6楼2014-04-15 21:14:27
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2014-04-15 18:35:15
非特异性片段，有时提高退火温度会有作用。。。
还有，可能污染杂菌。。。
另外，需要正对照，这样可以比较。。。

请问这一步的阳性对照要怎么做呢？
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越努力越幸运
7楼2014-04-15 21:15:11
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不爱做实验

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-15 21:15:11
请问这一步的阳性对照要怎么做呢？...

就是把片段作为模版，加0.5-1ul 进行和其他同等条件的PCR扩增。。。
正对照是检验你有没有将目的片段回收回来以及PCR条件是否合适。。。
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8楼2014-04-15 22:07:59
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2014-04-15 22:07:59
就是把片段作为模版，加0.5-1ul 进行和其他同等条件的PCR扩增。。。
正对照是检验你有没有将目的片段回收回来以及PCR条件是否合适。。。...

您这里说的“片段”是胶回收的产物吧？
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越努力越幸运
9楼2014-04-16 20:50:18
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PCR-CL

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
柠檬可乐星: 金币+2 2014-04-17 10:19:47
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-18 12:35:31
从菌液中扩增得到的结果，已经不错了！有点儿非特异扩增是正常的！

若想改善，方案：
1、提高退火温度。
2、换高退火、特异性高的引物。
3、。。。。。。

如果你的目的只是为了测序，那就不需要研讨条件，直接切胶回收后送测序就可以。
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10楼2014-04-16 21:19:39
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