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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR有杂带 已有5人参与

各位大虾,下面是我菌落PCR电泳检测的结果,主带是我的目的条带,但是这次PCR结果基本都有较明显的杂带,是我PCR操作的问题,还是其他什么原因呢?还有就是这样的菌液送测序,结果不好吗?

菌落PCR有杂带
2014.4.15-18s.png
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越努力越幸运
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是不是退火温度低了?

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-04-15 18:21:56
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-04-15 20:50:34
非特异性片段,有时提高退火温度会有作用。。。
还有,可能污染杂菌。。。
另外,需要正对照,这样可以比较。。。
3楼2014-04-15 18:35:15
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David勇

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-04-15 20:50:40
用的引物是通用引物吗?是不是挑克隆的时候无然杂菌,或者不是单克隆,有很多原因的,退火温度也可以高点试下。以前有没有做出过没有杂带的情况?
4楼2014-04-15 19:56:52
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-15 18:21:56
是不是退火温度低了?

退火温度跟平时做PCR时一样的,您的意思是这只是单纯的非特异性扩增?
越努力越幸运
5楼2014-04-15 21:09:46
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by David勇 at 2014-04-15 19:56:52
用的引物是通用引物吗?是不是挑克隆的时候无然杂菌,或者不是单克隆,有很多原因的,退火温度也可以高点试下。以前有没有做出过没有杂带的情况?

是用的我自己的特异性引物,以前做出来的会有一些拖带的情况
越努力越幸运
6楼2014-04-15 21:14:27
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2014-04-15 18:35:15
非特异性片段,有时提高退火温度会有作用。。。
还有,可能污染杂菌。。。
另外,需要正对照,这样可以比较。。。

请问这一步的阳性对照要怎么做呢?
越努力越幸运
7楼2014-04-15 21:15:11
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-15 21:15:11
请问这一步的阳性对照要怎么做呢?...

就是把片段作为模版,加0.5-1ul 进行和其他同等条件的PCR扩增。。。
正对照是检验你有没有将目的片段回收回来以及PCR条件是否合适。。。
8楼2014-04-15 22:07:59
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2014-04-15 22:07:59
就是把片段作为模版,加0.5-1ul 进行和其他同等条件的PCR扩增。。。
正对照是检验你有没有将目的片段回收回来以及PCR条件是否合适。。。...

您这里说的“片段”是胶回收的产物吧?
越努力越幸运
9楼2014-04-16 20:50:18
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PCR-CL

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
柠檬可乐星: 金币+2 2014-04-17 10:19:47
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-18 12:35:31
从菌液中扩增得到的结果,已经不错了!有点儿非特异扩增是正常的!

若想改善,方案:
1、提高退火温度。
2、换高退火、特异性高的引物。
3、。。。。。。

如果你的目的只是为了测序,那就不需要研讨条件,直接切胶回收后送测序就可以。
10楼2014-04-16 21:19:39
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