应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 琼脂糖凝胶电泳转化子菌落PCR产物，条带在槽里？
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
141/2返回列表12下一页
查看: 1945  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

林默泪

新虫 (初入文坛)

[求助] 琼脂糖凝胶电泳转化子菌落PCR产物，条带在槽里？

各位大神，求帮助，求解答。
我目的片段750bp，酶切链接转化到感受态JM109，平板上就长了几个菌落。
我挑菌，菌落PCR，酶用的是高保真酶KOD。
结果两次转化的所有PCR产物，两条带都在上样槽里。
MARKER，是DL2000，跑得很清楚。
求解答为什么？蛋白质污染？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-10-31 19:59:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
林默泪: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-11-04 16:17:06
做菌落PCR不需要用KOD酶，KOD酶扩增能力不行，换taq酶PCR一次试试
同时注意：
1. 菌体量不能太大，太大扩不出来
2. 预变性时间延长至5min，这一步煮菌，释放DNA
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-10-31 21:05:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-01 01:58:27
林默泪: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-11-04 16:17:20
菌落PCR的模板很脏的，一般只用于鉴定。通常点样孔会有点亮。你的情况应该是没有P出来。菌落PCR完全没有必要用高保真酶，普通的taq就很好，扩增效率高而且便宜。
赞一下 回复此楼
3楼2013-10-31 23:42:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-31 23:42:10
菌落PCR的模板很脏的，一般只用于鉴定。通常点样孔会有点亮。你的情况应该是没有P出来。菌落PCR完全没有必要用高保真酶，普通的taq就很好，扩增效率高而且便宜。

谢谢~
回复此楼
4楼2013-11-01 08:09:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-10-31 21:05:10
做菌落PCR不需要用KOD酶，KOD酶扩增能力不行，换taq酶PCR一次试试
同时注意：
1. 菌体量不能太大，太大扩不出来
2. 预变性时间延长至5min，这一步煮菌，释放DNA

菌体量的话，你是怎么控制的？
我是用最小的枪头挑的单菌落。
还有，预变性是2min，下次我试试5min。
赞一下 回复此楼
5楼2013-11-01 08:11:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 林默泪 at 2013-11-01 08:11:26
菌体量的话，你是怎么控制的？
我是用最小的枪头挑的单菌落。
还有，预变性是2min，下次我试试5min。...

枪头挑单菌落后洗在20ul水里面，然后取2ul做PCR模板，即可
变性时间一定是要5min
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-11-01 16:43:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-01 16:43:55
枪头挑单菌落后洗在20ul水里面，然后取2ul做PCR模板，即可
变性时间一定是要5min...

PCR的体系应该怎么样的量比较好呢？
我同学说检测10微升就够，师兄却让我用50微升的体系。
具体的用量怎么样比较好呢？求指教。
赞一下 回复此楼
7楼2013-11-02 23:14:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 林默泪 at 2013-11-02 23:14:41
PCR的体系应该怎么样的量比较好呢？
我同学说检测10微升就够，师兄却让我用50微升的体系。
具体的用量怎么样比较好呢？求指教。...

我用的是25ul体系，一般20ul体系就足够了，50ul有点浪费试剂
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2013-11-03 01:02:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-03 01:02:46
我用的是25ul体系，一般20ul体系就足够了，50ul有点浪费试剂...

具体呢？镁啊引物啊酶啊什么的？
拜托拜托具体讲一下~不胜感激。
赞一下 回复此楼
9楼2013-11-03 13:42:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 林默泪 at 2013-11-03 13:42:25
具体呢？镁啊引物啊酶啊什么的？
拜托拜托具体讲一下~不胜感激。...

PCR体系还要具体讲啊，我也不知道你用的什么酶啊，是2x mix还是每个组分都独立的呢，这个你看酶的说明书就可以了啊
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
10楼2013-11-03 22:15:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 林默泪 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 296求调剂 +3 汪！？！ 2026-04-05 4/200 2026-04-05 20:13 by 啵啵啵0119
[考研] 考研调剂生寻找导师 +3 顾瞻考研啊 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:18 by 啵啵啵0119
[考研] 385分 生物学（071000）求调剂 +11 qf626 2026-04-01 11/550 2026-04-05 17:35 by Ecowxq666！
[考研] 材料工程专硕求调剂 +11 hyl3153942 2026-03-29 11/550 2026-04-05 11:12 by 风雨无晴
[考研] 301求调剂 +12 121. 2026-04-04 12/600 2026-04-05 09:00 by 来看流星雨10
[考研] 313求调剂 +3 海日海日 2026-04-04 3/150 2026-04-05 07:48 by 544594351
[考研] 一志愿北京2，材料与化工308求调剂 +10 熊二想上岸 2026-04-04 10/500 2026-04-05 05:20 by houyaoxu
[考研] 考研调剂 +5 四川王涛 2026-04-04 5/250 2026-04-04 22:18 by 啵啵啵0119
[考研] 350一志愿北京航空航天大学08500材料科学与工程求调剂 +5 kjnasfss 2026-04-03 5/250 2026-04-03 22:29 by 无际的草原
[考研] 266求调剂 +18 阳阳哇塞 2026-04-01 18/900 2026-04-03 18:38 by zllcz
[考研] 285求调剂 +6 FZAC123 2026-03-30 6/300 2026-04-03 12:22 by xingguangj
[考研] 一志愿大工学硕，求调剂 +4 yub0811 2026-04-02 4/200 2026-04-02 21:36 by 百灵童888
[考研] 261求B区调剂 +5 明仔· 2026-04-01 7/350 2026-04-02 11:17 by 邹尉尉
[考研] 324求调剂 +5 想上学求调 2026-04-01 6/300 2026-04-02 10:16 by sanrepian
[考研] 266求调剂 +4 学员97LZgn 2026-04-02 4/200 2026-04-02 09:52 by yulian1987
[考研] 一志愿北交大材料工程，总分358 +4 cs0106 2026-04-01 4/200 2026-04-02 07:42 by 尚水阁主
[考研] 350求调剂 +7 阿佳～ 2026-03-31 7/350 2026-04-01 16:12 by yanflower7133
[考研] 一志愿北交材料工程总分358 +5 cs0106 2026-04-01 7/350 2026-04-01 11:45 by wangjy2002
[考研] 调剂申请 +8 张张张张zy 2026-03-31 9/450 2026-04-01 08:29 by zjbkx
[考研] 313求调剂 +6 卖个关子吧 2026-03-31 6/300 2026-03-31 10:58 by Jaylen.
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭