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林默泪

新虫 (初入文坛)

[求助] 琼脂糖凝胶电泳转化子菌落PCR产物，条带在槽里？

各位大神，求帮助，求解答。
我目的片段750bp，酶切链接转化到感受态JM109，平板上就长了几个菌落。
我挑菌，菌落PCR，酶用的是高保真酶KOD。
结果两次转化的所有PCR产物，两条带都在上样槽里。
MARKER，是DL2000，跑得很清楚。
求解答为什么？蛋白质污染？
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1楼 2013-10-31 19:59:43
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
林默泪: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-11-04 16:17:06
做菌落PCR不需要用KOD酶，KOD酶扩增能力不行，换taq酶PCR一次试试
同时注意：
1. 菌体量不能太大，太大扩不出来
2. 预变性时间延长至5min，这一步煮菌，释放DNA
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2楼2013-10-31 21:05:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-01 01:58:27
林默泪: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-11-04 16:17:20
菌落PCR的模板很脏的，一般只用于鉴定。通常点样孔会有点亮。你的情况应该是没有P出来。菌落PCR完全没有必要用高保真酶，普通的taq就很好，扩增效率高而且便宜。
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3楼2013-10-31 23:42:10
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林默泪

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-31 23:42:10
菌落PCR的模板很脏的，一般只用于鉴定。通常点样孔会有点亮。你的情况应该是没有P出来。菌落PCR完全没有必要用高保真酶，普通的taq就很好，扩增效率高而且便宜。

谢谢~
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4楼2013-11-01 08:09:23
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林默泪

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by gyesang at 2013-10-31 21:05:10
做菌落PCR不需要用KOD酶，KOD酶扩增能力不行，换taq酶PCR一次试试
同时注意：
1. 菌体量不能太大，太大扩不出来
2. 预变性时间延长至5min，这一步煮菌，释放DNA

菌体量的话，你是怎么控制的？
我是用最小的枪头挑的单菌落。
还有，预变性是2min，下次我试试5min。
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5楼2013-11-01 08:11:26
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gyesang

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5楼: Originally posted by 林默泪 at 2013-11-01 08:11:26
菌体量的话，你是怎么控制的？
我是用最小的枪头挑的单菌落。
还有，预变性是2min，下次我试试5min。...

枪头挑单菌落后洗在20ul水里面，然后取2ul做PCR模板，即可
变性时间一定是要5min
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6楼2013-11-01 16:43:55
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林默泪

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-01 16:43:55
枪头挑单菌落后洗在20ul水里面，然后取2ul做PCR模板，即可
变性时间一定是要5min...

PCR的体系应该怎么样的量比较好呢？
我同学说检测10微升就够，师兄却让我用50微升的体系。
具体的用量怎么样比较好呢？求指教。
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7楼2013-11-02 23:14:41
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gyesang

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7楼: Originally posted by 林默泪 at 2013-11-02 23:14:41
PCR的体系应该怎么样的量比较好呢？
我同学说检测10微升就够，师兄却让我用50微升的体系。
具体的用量怎么样比较好呢？求指教。...

我用的是25ul体系，一般20ul体系就足够了，50ul有点浪费试剂
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8楼2013-11-03 01:02:46
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林默泪

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8楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-03 01:02:46
我用的是25ul体系，一般20ul体系就足够了，50ul有点浪费试剂...

具体呢？镁啊引物啊酶啊什么的？
拜托拜托具体讲一下~不胜感激。
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9楼2013-11-03 13:42:25
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gyesang

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9楼: Originally posted by 林默泪 at 2013-11-03 13:42:25
具体呢？镁啊引物啊酶啊什么的？
拜托拜托具体讲一下~不胜感激。...

PCR体系还要具体讲啊，我也不知道你用的什么酶啊，是2x mix还是每个组分都独立的呢，这个你看酶的说明书就可以了啊
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10楼2013-11-03 22:15:01
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