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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒双酶切
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lxyzsx

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒双酶切 已有6人参与

本人最近构建真核表达载体，提取重组质粒pcr有目的条带，而双酶切没有目的条带。为了检验酶活，分别单酶切，全都切开。各位大神，遇到这种情况是不是pcr出现假阳性了？我决定拿出去测序，如果测序结果正确，那怎么会出现双酶切切不出目的条带呢？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

[ Last edited by silicare on 2014-2-18 at 08:54 ]
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1楼 2014-01-16 19:33:30
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2014-01-16 21:28:22
可能出现污染了，测序结果对的话肯定能切开。
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hehe
2楼2014-01-16 20:23:26
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月季花yrg

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-16 21:28:32
测序正确的话肯定不是假阳性了，可能是一些特殊结构保护了酶切位点，就是切不开，可以直接用，但保险起见，建议重新换酶切位点冲构载体
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3楼2014-01-16 21:24:04
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-18 11:49:44
可能双酶切效率非常低，建议更换buffer，或分步酶切
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做一个阳光、开朗的小和尚
4楼2014-01-16 21:42:28
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永远一片天

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-18 11:49:47
很有可能，您的两个酶切位点离得太近，保护碱基不足，会出现这种情况的。离得太近，会有位阻影响，需要进行两次单酶切。
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5楼2014-02-17 21:08:19
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-02-18 11:49:51
哎。。。何必纠结，一看就知道是菌落PCR假阳性。多做几个，挑取一下就好了。双酶切考虑buffer都好多年前的事情了，现在都有通用buffer的，你用thermo的酶再做做试试。位阻的考虑也是过多了，实际上虽然两个离得很近，但是由于另外一边的序列实在太长了，最后的结果就造成质粒异常的好切。不用考虑过近的问题。
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6楼2014-02-17 22:02:37
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forrestgump

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

双酶切是公用buffer吗？可能就出在共同切上了？还有一种可能是你这个酶切位点有问题，切开是的其他部位的，所以不见目的条带。
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7楼2014-02-18 14:29:45
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
两个酶的温度，Buffer,质粒的浓度都要注意。
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8楼2014-02-18 16:56:24
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