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lxyzsx

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒双酶切已有6人参与

本人最近构建真核表达载体,提取重组质粒pcr有目的条带,而双酶切没有目的条带。为了检验酶活,分别单酶切,全都切开。各位大神,遇到这种情况是不是pcr出现假阳性了?我决定拿出去测序,如果测序结果正确,那怎么会出现双酶切切不出目的条带呢?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

[ Last edited by silicare on 2014-2-18 at 08:54 ]
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

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感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2014-01-16 21:28:22
可能出现污染了,测序结果对的话肯定能切开。
hehe
2楼2014-01-16 20:23:26
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月季花yrg

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-16 21:28:32
测序正确的话肯定不是假阳性了,可能是一些特殊结构保护了酶切位点,就是切不开,可以直接用,但保险起见,建议重新换酶切位点冲构载体
3楼2014-01-16 21:24:04
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

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★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-18 11:49:44
可能双酶切效率非常低,建议更换buffer,或分步酶切
做一个阳光、开朗的小和尚
4楼2014-01-16 21:42:28
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永远一片天

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-18 11:49:47
很有可能,您的两个酶切位点离得太近,保护碱基不足,会出现这种情况的。离得太近,会有位阻影响,需要进行两次单酶切。
5楼2014-02-17 21:08:19
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)


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★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-02-18 11:49:51
哎。。。何必纠结,一看就知道是菌落PCR假阳性。多做几个,挑取一下就好了。双酶切考虑buffer都好多年前的事情了,现在都有通用buffer的,你用thermo的酶再做做试试。位阻的考虑也是过多了,实际上虽然两个离得很近,但是由于另外一边的序列实在太长了,最后的结果就造成质粒异常的好切。不用考虑过近的问题。
6楼2014-02-17 22:02:37
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forrestgump

新虫 (著名写手)

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双酶切是公用buffer吗?可能就出在共同切上了?还有一种可能是你这个酶切位点有问题,切开是的其他部位的,所以不见目的条带。
7楼2014-02-18 14:29:45
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

两个酶的温度,Buffer,质粒的浓度都要注意。
8楼2014-02-18 16:56:24
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