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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 融合蛋白表达只出现前半部分蛋白条带
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samqueenw

银虫 (初入文坛)

[求助] 融合蛋白表达只出现前半部分蛋白条带已有4人参与

最近做融合蛋白，pet21a做载体，融合21kd和28kd的蛋白
构建后的载体经测序没有问题，前边21KD蛋白的终止密码子已经被去除，但是表达诱导后SDS凝胶电泳只在21KD的位置有表达条带（表达条件：37度；分别试了OD600=0.5,0.7,1.0; IPTG终浓度为0.3,0.5,1.0mM；诱导1h，3h，过夜。最后发现只要诱导过夜，就会有出现表达条带）
请各位做过融合蛋白的高手赐教啊
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懂得真少
1楼2013-12-04 16:13:18
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chlorella409

木虫 (正式写手)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-20 15:26:34
引用回帖:
5楼: Originally posted by samqueenw at 2013-12-19 21:24:08
那个是啥？不懂啊，能帮助完整表达么...

我理解为你要在一个载体上表达两个蛋白，所以要翻译第二个蛋白要在第二个蛋白前结合一个核糖体上去，看到你把第一个蛋白后面的终止子去除了，我理解为你要将两个蛋白连接起来表达为一个蛋白，这种情况下第二个蛋白没有表达出来很常见，因为融合蛋白太长翻译中间丢失了
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10楼2013-12-20 13:00:13
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:26:29
一个载体表达两个蛋白本来就很难的，你两个蛋白基因中间有没有再加个核糖体结合位点的基因
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4楼2013-12-13 08:41:07
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samqueenw

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chlorella409 at 2013-12-13 08:41:07
一个载体表达两个蛋白本来就很难的，你两个蛋白基因中间有没有再加个核糖体结合位点的基因

那个是啥？不懂啊，能帮助完整表达么
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懂得真少
5楼2013-12-19 21:24:08
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
samqueenw(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2013-12-20 15:26:26
楼主这种情况我也遇到过,以下是我的经验,希望对你能有帮助:
我有一个蛋白怎么表达都不溶,没有办法了只好做了个融合蛋白,N端的是可溶的标签蛋白
但是IPTG诱导表达的结果是只看到了对应于融合的N端的可溶标签蛋白有很强诱导条带, 融合蛋白的全长条带很弱或者几乎看不到. 用N端his-tag做纯化可以拿到混合物,其中对应于前半部分的条带明显比对应于融合蛋白全长的条带要深
我把全长融合蛋白用HPLC分离出来, 然后用酶把融合蛋白从中间切开,结果后半部分就全部都沉淀了,上清夜里只有前半部分
我推测是因为融合蛋白的后半部分本身不能正确折叠, 所以e.coli.的某种机制就会倾向于把折叠和溶解度特别好的前半部分切下来. 而且对于融合蛋白来说, 两个融合部分的连接处本来也没有结构,也容易被各种蛋白酶非特异性地切开
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
6楼2013-12-20 03:42:31
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