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samqueenw

银虫 (初入文坛)

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[求助] 融合蛋白表达只出现前半部分蛋白条带已有4人参与

最近做融合蛋白，pet21a做载体，融合21kd和28kd的蛋白
构建后的载体经测序没有问题，前边21KD蛋白的终止密码子已经被去除，但是表达诱导后SDS凝胶电泳只在21KD的位置有表达条带（表达条件：37度；分别试了OD600=0.5,0.7,1.0; IPTG终浓度为0.3,0.5,1.0mM；诱导1h，3h，过夜。最后发现只要诱导过夜，就会有出现表达条带）
请各位做过融合蛋白的高手赐教啊

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懂得真少

1楼2013-12-04 16:13:18

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fuyuandj86

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
samqueenw(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2013-12-20 15:26:26

楼主这种情况我也遇到过,以下是我的经验,希望对你能有帮助:
我有一个蛋白怎么表达都不溶,没有办法了只好做了个融合蛋白,N端的是可溶的标签蛋白
但是IPTG诱导表达的结果是只看到了对应于融合的N端的可溶标签蛋白有很强诱导条带, 融合蛋白的全长条带很弱或者几乎看不到. 用N端his-tag做纯化可以拿到混合物,其中对应于前半部分的条带明显比对应于融合蛋白全长的条带要深
我把全长融合蛋白用HPLC分离出来, 然后用酶把融合蛋白从中间切开,结果后半部分就全部都沉淀了,上清夜里只有前半部分
我推测是因为融合蛋白的后半部分本身不能正确折叠, 所以e.coli.的某种机制就会倾向于把折叠和溶解度特别好的前半部分切下来. 而且对于融合蛋白来说, 两个融合部分的连接处本来也没有结构,也容易被各种蛋白酶非特异性地切开