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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » [求助]蓝白斑筛选不长菌
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幻影望晴

新虫 (初入文坛)

[求助] [求助]蓝白斑筛选不长菌 已有1人参与

之前做过很多次都没出现过这个问题，这次也是按照原来的方法做的，竟然不长菌。载体是天根的pGM-T，感受态是JM109，目的片段500bp左右，也是用天根的胶回收做的。失败后，考虑了连接和感受态细胞的问题。
1.连接的验证
模板：载体试剂盒中的control insert DNA(700bp)
引物：SP6、T7
结果：

2.感受态细胞
本来以为是我的JM109是不是传代出现问题了，用新的JM109做的。
A.连接载体转入CP cell，37度振荡培养1h后，有晕状浑浊出现，涂于LB+（表面涂有IPTG16μl，X-gal 40μl)平板培养基，37度培养15小时，不长菌。
B.单独的CP cell分别涂了LB+和LB-两个平板培养基，两个都长菌了，涂LB-的长的比LB+的多。

真的是特别的郁闷，请大家多多指教！先说声谢谢！！
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1楼 2013-10-29 09:52:53
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幻影望晴

新虫 (初入文坛)
咦！！图怎么没出现呢！补一张
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2楼2013-10-29 09:55:21
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幻影望晴

新虫 (初入文坛)
第一次发图，不太懂，不好意思！！
[img]http://529688.m2.ihompy.com.cn/201310/29/529688_1383010606VQcF690.jpg[img]
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3楼2013-10-29 09:57:44
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shouyishuo

铜虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 11:47:18
别的不说，单纯从你描述的感受态验证的结果就发现一个问题：单纯的感受态涂LB+是不能够长菌的，涂LB-长菌是正常的...现在涂LB+的都长菌了，可能是制备的感受态被污染了，或者说不纯...
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4楼2013-11-02 09:49:19
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幻影望晴

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shouyishuo at 2013-11-02 09:49:19
别的不说，单纯从你描述的感受态验证的结果就发现一个问题：单纯的感受态涂LB+是不能够长菌的，涂LB-长菌是正常的...现在涂LB+的都长菌了，可能是制备的感受态被污染了，或者说不纯...

是这个问题的，之后重新做了一下，LB+就没有长菌了，但是目的基因的连接转化后仍然不长菌，我在考虑是不是连接出现问题了，但是如果连接出现问题的话我还不知道要怎么验证，不知道确切的原因
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5楼2013-11-04 16:11:26
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shouyishuo

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 幻影望晴 at 2013-11-04 16:11:26
是这个问题的，之后重新做了一下，LB+就没有长菌了，但是目的基因的连接转化后仍然不长菌，我在考虑是不是连接出现问题了，但是如果连接出现问题的话我还不知道要怎么验证，不知道确切的原因...

不好意思，很久没上论坛了，不知道你的T克隆连接成功没有？
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6楼2013-12-11 20:22:53
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-12 00:37:47
……这个问题还真棘手%LB没有涂抗生素？那么蓝白斑就算长起来也不保险……
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我不会！
7楼2013-12-11 22:49:32
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