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PCR特异性问题求助
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如题，最近在做分子克隆，根据一段序列设计了引物，使用反转录出来的cDNA作为模板，但是结果一直很不理想 做了一下温度梯度进行PCR，结果还是这样，求帮忙分析 一共是3对引物 marker使用的是DS2000 左右两边各位marker，中间每三个为一个温度，每个温度从左到右产物长度分别是400+，600+，200+ [ Last edited by 我要吃西瓜 on 2013-9-28 at 12:45 ] |
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hl16010921
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-09-29 10:14:13
我要吃西瓜: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-09-29 19:55:53
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1.引物设计好要在NCBI的blast上检索特异性，看看能不能引起非特异扩增。如果非特异的片段和目的片段差异小而且同引物的匹配度高，则修改引物。（特异性不好，单靠调整PCR条件是不行的）。 2.600bp降低引物浓度，减少延伸时间电泳时间延长。400bp的退火温度降一点试试。200bp的温度左一，左二左右。然后胶回收目的带，稀释100到1000倍做模板，做二次PCR试试（突变率会高一些，循环数25左右）。 |
5楼2013-09-29 09:04:53
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