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jmmchen

木虫 (正式写手)

[求助] 求助MSP凝胶电泳该如何选择已有2人参与

请问大家有做甲基化特异性PCR的吗???
目前,我的研究课题是有关DNA甲基化的,经过PCR之后,我一般都是跑2%琼脂糖凝胶电泳,但最终结果一般会出现以下几个问题:
(1)对于我选择的目的基因,正常人的骨髓中应当是无甲基化的,文献报道正常人中应该没有甲基化。但我的电泳跑出来之后是有甲基化的。不知道是我的引物设计不合理,还是其他原因??
(2)导师觉得我跑的条带不好看,希望改用PAGE凝胶进行电泳,我自认为这种办法不可取。不知道大家做甲基化PCR的,有用PAGE胶进行电泳的吗??
如果有用PAGE胶的,请传授一下经验吧。
非常感谢!!!


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jmmchen

木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by happyxiaoli at 2012-09-17 22:01:13
楼主,您好,方便留下个联系的邮箱吗?我也在做甲基化,遇到困难了,我是扩不出来条带,求交流。谢谢!

我的邮箱是j.mmchen@163.com,有问题可以给我发E-Mail。
面朝大海,春暖花开
10楼2012-09-18 17:48:56
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普通回帖

jmmchen

木虫 (正式写手)

竟然没有做的,好可怜呢
面朝大海,春暖花开
2楼2012-05-20 23:19:09
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【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-22 13:47:35
甲基化特异性PCR即MSP的方法,成功的关键是在引物的设计上面,不知您购买的相关的DNA甲基化修饰试剂盒是哪家公司的;同时,您可以通过调整引物设计来着手找问题,您是设计的一对甲基化引物和一对非甲基化引物吗?您使用的酶是哪家公司的,这也是一个关键的地方,主要是看此酶的特异性是否较高!
3楼2012-05-22 09:53:42
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jmmchen

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by ADTechnology at 2012-05-22 09:53:42:
甲基化特异性PCR即MSP的方法,成功的关键是在引物的设计上面,不知您购买的相关的DNA甲基化修饰试剂盒是哪家公司的;同时,您可以通过调整引物设计来着手找问题,您是设计的一对甲基化引物和一对非甲基化引物吗?您

您好,我用的DNA甲基化修饰试剂盒是INVITROGEN公司的EpiTect bisulfite kit,按操作流程修饰即可。通过甲基化引物设计软件设计一对甲基化引物和一对非甲基化引物。我不知道你用的缓冲液是不是Hermans buffer,我采用的是2 GoTaq green master mix,简单方便,扩增效率还是蛮高的。请你再指点一下吧,谢谢
面朝大海,春暖花开
4楼2012-05-22 14:35:50
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【答案】应助回帖

★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励下 2012-05-23 21:48:59
您说的这个产品应该不是INVITROGE公司的,应该是QIAGEN的吧!呵呵!一般情况下,按照操作流程进行操作不会有什么问题的。一般引物设计软件采用Methl primer就可以的。至于您说的这个酶(2 GoTaq green master mix)应该是Promega的。亚硫酸盐的修饰的盒子还可以,但是与这个酶的匹配性如何!您这边有没有使用这个酶跑出来的条带呢?有的话,可以发到我的信箱一份,我的信箱是:tech@aderr.com
5楼2012-05-23 09:46:51
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jmmchen

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by ADTechnology at 2012-05-23 09:46:51:
您说的这个产品应该不是INVITROGE公司的,应该是QIAGEN的吧!呵呵!一般情况下,按照操作流程进行操作不会有什么问题的。一般引物设计软件采用Methl primer就可以的。至于您说的这个酶(2 GoTaq green master mix)

谢谢您的帮助,您了解的还挺多的,我现在已经找到解决问题的突破口了,谢谢您的回复,好人!!哈哈哈
面朝大海,春暖花开
6楼2012-05-23 21:40:23
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ADTechnology

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7楼2012-05-23 22:24:23
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jqzhu1998

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

MSP检测单个CpG位点,用于细胞系较好
如果你设计的引物与文献中报道的不一致,也就是说,你分析的单个CpG位点与文献中报道的位点不一致,这样的话,结果没有可比性,既然已经做了修饰,为什么不做BSP了?结果会更好,更有说服力。
8楼2012-07-01 16:51:31
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happyxiaoli

铜虫 (小有名气)

楼主,您好,方便留下个联系的邮箱吗?我也在做甲基化,遇到困难了,我是扩不出来条带,求交流。谢谢!
读书需用意,一字值千金!
9楼2012-09-17 22:01:13
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