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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】蛋白质非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
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shiniyuanai

新虫 (小有名气)

[求助] 【求助】蛋白质非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

最近我一直在跑蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，已经试过很多次，还是跑不好。
    我的蛋白是pI为6.3~7.6的稻米蛋白，14kD~16kD，不止一种蛋白。参考王家政的蛋白技术手册，用的是10%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳缓冲液的pH是8.8，冰浴电泳，但是跑出来的效果非常不好，条带如下，连浓缩胶里面都有条带，但是跑SDS-PAGE的时候是好的啊！！图片也贴在下面。

目标蛋白 SDS-PAGE.png



目标蛋白 Native-PAGE.png 脱色比较完全后在浓缩胶内能看到拖尾的条带。。。
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1楼 2012-10-09 13:21:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

shiniyuanai

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-09 15:35:12
增溶的目的是利用detergent包被在蛋白分子的表面，使他们不发生聚合沉淀。你的浓缩胶里面的条带大概是聚合沉淀的蛋白。由于发生聚合，分子量变大，无法进入分离胶。...


终于找到一个出口。
但是我没用过detergent，Triton X-100能用于我的实验吗？？我查了一下，是否0.1%的Triton X-100这样的浓度比较适合溶解我的样品？？
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6楼2012-10-09 15:55:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiniyuanai: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢，真是好人 2012-10-09 15:19:07
非变性电泳条件下，蛋白依靠的是本身的负电荷移动，比起普通的SDS-PAGE，跑起来要慢得多。而且如果样品浓度过高会引起聚合沉淀。从你的胶看来可能就是这种情况。你可以用一些较弱的非离子去垢剂（例如Triton X-100）增溶一下样品。不知道你跑非变性胶的目的，是做in gel活性染色还是只想要分开不同的蛋白呢？
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zh910917
3楼2012-10-09 14:53:18
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baoshiling

银虫 (小有名气)
有时蛋白本身的性质决定了在native胶中有多种形式看起来会smear，但当找到了其配体或者互作的蛋白等一起电泳时就会出现非常漂亮的一条带。
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相信自己，怒放生命
16楼2014-10-09 08:21:28
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普通回帖

卡门旺角

金虫 (小有名气)
不懂帮顶!!
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shiniyuanai
2楼2012-10-09 14:06:57
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shiniyuanai

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-09 14:53:18
非变性电泳条件下，蛋白依靠的是本身的负电荷移动，比起普通的SDS-PAGE，跑起来要慢得多。而且如果样品浓度过高会引起聚合沉淀。从你的胶看来可能就是这种情况。你可以用一些较弱的非离子去垢剂（例如Triton X-100） ...

我有几点想说明一下。
1. 增溶的目的是什么呢？？稀释样品？？我的样品溶解性还是非常好的。
2. 我的目的是分开不同的蛋白，在SDS-PAGE中，由于分子量大小相近，分不开了。
3. 浓缩胶里也有条带是为什么呢？？
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4楼2012-10-09 15:25:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shiniyuanai at 2012-10-09 15:25:05
我有几点想说明一下。
1. 增溶的目的是什么呢？？稀释样品？？我的样品溶解性还是非常好的。
2. 我的目的是分开不同的蛋白，在SDS-PAGE中，由于分子量大小相近，分不开了。
3. 浓缩胶里也有条带是为什么呢？？...

增溶的目的是利用detergent包被在蛋白分子的表面，使他们不发生聚合沉淀。你的浓缩胶里面的条带大概是聚合沉淀的蛋白。由于发生聚合，分子量变大，无法进入分离胶。
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5楼2012-10-09 15:35:12
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eulota

金虫 (著名写手)
我们做植物蛋白电泳的样品中一般TritonX100的浓度是1%
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shiniyuanai
7楼2012-10-09 19:48:26
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shiniyuanai

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by eulota at 2012-10-09 19:48:26
我们做植物蛋白电泳的样品中一般TritonX100的浓度是1%

那我能问一下，你们实验电泳时，是如何加Triton X-100的啊？？是在溶解蛋白的时候用Triton X-100溶解，还是电泳制样时加入？？
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8楼2012-10-09 20:53:09
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shiniyuanai

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡门旺角 at 2012-10-09 14:06:57
不懂帮顶!!

非常感谢你最真诚的支持！！！
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9楼2012-10-09 21:55:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shiniyuanai at 2012-10-09 15:55:33

终于找到一个出口。
但是我没用过detergent，Triton X-100能用于我的实验吗？？我查了一下，是否0.1%的Triton X-100这样的浓度比较适合溶解我的样品？？...

浓度要靠自己试，因为不同的样品所需的浓度不一样，可以从0.1-2%做个梯度。
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10楼2012-10-10 07:59:35
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