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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】非变性聚丙烯酰胺电泳
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sun1123moon

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】非变性聚丙烯酰胺电泳 已有8人参与

我是新手做非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，1）配制分离胶和浓缩胶的浓度是怎样的？
2）我要做凝胶的正交实验，选出同工酶酶带最好的分离胶和浓缩胶浓度，应该怎样设计，各成分的体积需要多少？
谢谢！
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1楼 2010-10-10 13:22:37
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sweetbobo

银虫 (小有名气)
★
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这个配溶液最好去找你们学校的学生物的专业，新手最好要有人带着做试验，不然很绕弯
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2楼2010-10-10 14:03:23
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hjxbjc

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+2):鼓励新人回答 2010-10-22 13:04:55
从网上搜索一些。如果没有人问的话可以尝试的做一下。我当时也是白手起家，自己琢磨的。大概1个月才摸索出门道。我以前做过非变性的分离牛奶蛋白。
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奔波在乳酸菌世界里的一只蜗牛——吃辣椒ing！！！
3楼2010-10-10 14:29:12
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
好好查阅文献，好哈的设计实验方案，这是很重要滴~
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4楼2010-10-10 14:42:57
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sun1123moon

铜虫 (小有名气)
灌胶时要不要考虑温度？

[ Last edited by sun1123moon on 2010-10-13 at 11:10 ]
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5楼2010-10-13 11:04:11
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hjxbjc

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by sun1123moon at 2010-10-13 11:04:11:
灌胶时要不要考虑温度？

[ Last edited by sun1123moon on 2010-10-13 at 11:10 ]

灌胶不用考虑温度，但是要控制好加入凝固剂的条件和时间，加入后就必须马上注胶。
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奔波在乳酸菌世界里的一只蜗牛——吃辣椒ing！！！
6楼2010-10-13 14:00:25
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sun1123moon

铜虫 (小有名气)
聚合的时候考虑温度吗？
像现在这种天气16度-20度左右，在室温下聚合的好吗
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7楼2010-10-13 17:24:48
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ben1147

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-13 21:26:55
温度不是太大的问题，16-20是比较正常的室温

关键是要让聚合过程控制在40min-1h之内，太快了胶凝的不匀，太慢了浪费时间

浓缩胶浓度基本不影响实验的，5%左右就行

至于分离胶，非变性胶目的蛋白的迁移性质不太好确定，可以先大概从一个常用的浓度开始，比如12%或者15%，跑几次，看看情况再决定提高或降低浓度，并且要确定相应的电泳条件（电压、时间），毕竟这三者是相互关联的
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8楼2010-10-13 21:14:59
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biodadiao

铜虫 (小有名气)
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看天(金币+2):热心 2010-10-22 13:05:14
不管是变性还是非变性，浓缩胶的浓度都是确定的，按照protocol就可以。
分离胶的浓度要根据你的目标条带大小而确定。

配置非变性最重要的是，所有用到SDS的地方都要用DTT代替，电泳时尽管选用低温下进行，最好是4度，电压一般可以低些。
考虑到未聚合的丙烯酰胺单体对蛋白造成的失活，可以采用过夜预电泳。
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9楼2010-10-13 22:21:30
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sun1123moon

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-10-13 21:14:59:
温度不是太大的问题，16-20是比较正常的室温

关键是要让聚合过程控制在40min-1h之内，太快了胶凝的不匀，太慢了浪费时间

浓缩胶浓度基本不影响实验的，5%左右就行

至于分离胶，非变性胶目的蛋白的迁移性 ...

我做的分离胶聚合差不多40分钟，但是浓缩胶聚合非常慢！用了我四个小时！
不知道到底是什么问题？
我浓缩胶配方如下：
浓缩胶缓冲液   1.25ml
浓缩胶母液       2.5ml
核黄素             1.25ml
蔗糖               5ml
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10楼2010-10-22 11:57:15
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