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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » CRP的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
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芯片妞妞

新虫 (初入文坛)

[求助] CRP的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

有人跑过CRP的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳吗？  我已经跑了快1个月了，还没有得到想要的结果。我是想通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来验证一条DNA链与CRP的结合情况，可是跑到现在，每次只有CRP的条带，并且CRP只跑出泳道口一点点，大概0.5cm的样子，以前考虑可能是CRP的分子量太大了，跑的慢，所以就延长的电泳的时间到5个小时，但是效果没什么改进，不知道是什么原因？恳请各位能提出宝贵的建议或方法！另外，还有个问题是为什么随着电泳时间的延长，电流会越来越小? 这个对电泳结果有影响吗？
我现在电泳条件是：电压120V（以前是80V）  电泳缓冲液是TB   4%的胶

再次恳请各位帮忙！先谢谢大家了！

最上面的三个泳道相同位置处的条带是CRP的
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1楼 2012-07-19 22:33:26
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+5, 强人，欢迎常来交流 2012-07-20 08:46:54
电流变小的可能原因是，
1. 你没有用循环水将胶板降温，因为再长时间的电泳下，胶板发热，导致电阻变大而电流变小。
2，你的电机缓冲液渗漏，页面无法覆盖胶的最上部
楼主可以考虑，1，加循环水降温胶板
              2， 楼主不要恒压，用横流。
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芯片妞妞
2楼2012-07-20 08:41:31
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芯片妞妞

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-20 08:41:31
电流变小的可能原因是，
1. 你没有用循环水将胶板降温，因为再长时间的电泳下，胶板发热，导致电阻变大而电流变小。
2，你的电机缓冲液渗漏，页面无法覆盖胶的最上部
楼主可以考虑，1，加循环水降温胶板
       ...

谢谢您的建议！
我是在冰上跑的，效果应该和循环水差不多吧
电泳时用恒压还是恒流，是根据什么来选择的？
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3楼2012-07-20 13:04:18
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 芯片妞妞 at 2012-07-20 13:04:18
谢谢您的建议！
我是在冰上跑的，效果应该和循环水差不多吧
电泳时用恒压还是恒流，是根据什么来选择的？...

你用的是什么电泳仪啊，无法设定横流哇？
冰上的话不能把整个胶板都降温把，也可以用长一点的导线把你的胶在4度冰箱内跑也是可以的。
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4楼2012-07-20 14:46:33
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芯片妞妞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-20 14:46:33
你用的是什么电泳仪啊，无法设定横流哇？
冰上的话不能把整个胶板都降温把，也可以用长一点的导线把你的胶在4度冰箱内跑也是可以的。...

我用的是北京百晶生物技术有限公司的BG-verMINI 迷你垂直电泳仪，应该能设定恒流的
大分子量的蛋白很难跑啊，都跑了那么长时间怎么就跑出那么一点点，我都没辙儿了!
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5楼2012-07-20 16:08:41
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
芯片妞妞: 金币+10, ★有帮助 2012-07-25 08:19:34
非变性胶的电泳，蛋白质的分离取决于其所带的电荷以及分子大小。此外，在正式点样电泳前，可以预电泳30-60分钟，一般变性的预电泳，但是也有报道非变性的也用预电泳。楼主，如果你的分子量确实太大，可以考虑加大电流或电压，在冰箱内电泳。此外，你的样品制备没有问题吧哈。例如你的样品所在提取液或者换缓冲液的ph等也可能影响迁移速度。
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芯片妞妞
6楼2012-07-20 17:06:52
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芯片妞妞

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
6楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-20 17:06:52
非变性胶的电泳，蛋白质的分离取决于其所带的电荷以及分子大小。此外，在正式点样电泳前，可以预电泳30-60分钟，一般变性的预电泳，但是也有报道非变性的也用预电泳。楼主，如果你的分子量确实太大，可以考虑加大电 ...

是的，我每次都预跑30分钟。CRP分子量是115KD
样品的缓冲液和电泳缓冲液的PH是一样的
我还有一个疑问：Loading agent 什么时候加？是和其他样品一起加入再共孵育，还是让样品先孵育好在上样之前再快速加入Loading agent ？这个会有影响不？
谢谢你！
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7楼2012-07-21 10:40:11
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