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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 银染色聚丙烯酰胺凝胶电泳
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yanfeier

金虫 (小有名气)

[求助] 银染色聚丙烯酰胺凝胶电泳

想问问各位谁做过银染色聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中在试验过程中胶的做法和之前鉴定蛋白PAGE胶区别在哪里，以及对样品的要求等等，求大侠指教，我主要是想做多态性分析的。
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1楼2012-04-24 10:11:28
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-24 13:49:05
yanfeier: 金币+5 2012-04-24 16:12:54
不分浓缩胶与分离胶，我把我们10%配方给你
                 60ml
40%丙烯酰胺    15ml
H2O                   38.4ml
10*TBE                6ml
10%APS             0.6ml
TEMED              48.75ul
160v电泳 1h 银染照相
我实验室就采用这种方式。
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hehe
4楼2012-04-24 11:45:08
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 可否详细点呢 2012-04-24 11:38:06
银染色聚丙烯酰胺凝胶跟PAGE胶一样。只是染色观察不同。
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hehe
2楼2012-04-24 10:22:15
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yanfeier

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2012-04-24 10:22:15:
银染色聚丙烯酰胺凝胶跟PAGE胶一样。只是染色观察不同。

那我看的文献上面直接说用10%变性聚丙烯酰胺凝胶，这个不分浓缩胶与分离胶吗？还有就是它的跑胶条件也不尽相同，所以就不明白了。是否可以帮忙解释下。
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3楼2012-04-24 11:24:34
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yanfeier

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvbobo823 at 2012-04-24 11:45:08:
不分浓缩胶与分离胶，我把我们10%配方给你
                 60ml
40%丙烯酰胺    15ml
H2O                   38.4ml
10*TBE                6ml
10%APS             0.6ml
TEMED              48.75ul
...

谢谢你，但是我看你们的配方和跑蛋白的PAGE还是有点不一样，是TBE（与TAE区别，我只在琼脂糖电泳里面用过）？不用Tris-Hcl吗？直接也不用调电压，银染完了之后不就是直接显色吗？照相？  我对这个实验流程还没有实际操作过，对于整体的实验流程还不是很熟悉。你们跑完胶之后，具体每一步的操作和时间是怎么安排的？比如说固定液、银染液以及显色液配方和每步的时间等等，能不能耽误你点时间，给我讲讲。拜托了。
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5楼2012-04-24 12:26:16
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
yanfeier: 金币+5 2012-04-24 16:12:58
TBE配方可以在分子克隆那本书上查到网上也容易搜到，我就不给你细说了。
银染过程是：
1.电泳完毕后，取下胶水洗1min
2.银染(1g AgNO3+1L H2O)至少8min
3.再水洗1min
4.把胶转移到NaOH显影液中（16g NaOH+8ml 甲醛+1L H2O），边染色边观察直到显出带时，把胶转移到Na2CO3溶液（7.5g Na2CO3+1L H2O）终止反应2min
5.放入稍些水中照相。
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hehe
6楼2012-04-24 14:10:02
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yanfeier

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yanfeier at 2012-04-24 12:26:16:
谢谢你，但是我看你们的配方和跑蛋白的PAGE还是有点不一样，是TBE（与TAE区别，我只在琼脂糖电泳里面用过）？不用Tris-Hcl吗？直接也不用调电压，银染完了之后不就是直接显色吗？照相？  我对这个实验流程还没有 ...

那PCR产物上胶跑之前是不是也的加入5*loadingbuffer煮沸呢？
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7楼2012-04-24 14:29:28
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普通回帖

syct

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yanfeier at 2012-04-24 14:29:28:
那PCR产物上胶跑之前是不是也的加入5*loadingbuffer煮沸呢？

PCR产物跑胶前煮沸？
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8楼2012-04-25 01:00:09
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)
晕，你到底是要跑核酸还是跑蛋白啊。
银染是用来染蛋白的。染核酸用EB不就行了
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9楼2012-04-25 08:25:29
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yanfeier

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by dnaxxx at 2012-04-25 08:25:29:
晕，你到底是要跑核酸还是跑蛋白啊。
银染是用来染蛋白的。染核酸用EB不就行了

可能是我描述的不清楚,你理解错我的意思了。不好意思
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10楼2012-04-25 10:37:29
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