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芯片妞妞

新虫 (初入文坛)

[求助] CRP的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

有人跑过CRP的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳吗?  我已经跑了快1个月了,还没有得到想要的结果。我是想通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来验证一条DNA链与CRP的结合情况,可是跑到现在,每次只有CRP的条带,并且CRP只跑出泳道口一点点,大概0.5cm的样子,以前考虑可能是CRP的分子量太大了,跑的慢,所以就延长的电泳的时间到5个小时,但是效果没什么改进,不知道是什么原因?恳请各位能提出宝贵的建议或方法!另外,还有个问题是为什么随着电泳时间的延长,电流会越来越小? 这个对电泳结果有影响吗?
我现在电泳条件是:电压120V(以前是80V)  电泳缓冲液是TB   4%的胶

再次恳请各位帮忙!先谢谢大家了!

最上面的三个泳道相同位置处的条带是CRP的
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+5, 强人,欢迎常来交流 2012-07-20 08:46:54
电流变小的可能原因是,
1. 你没有用循环水将胶板降温,因为再长时间的电泳下,胶板发热,导致电阻变大而电流变小。
2,你的电机缓冲液渗漏,页面无法覆盖胶的最上部
楼主可以考虑,1,加循环水降温胶板
              2, 楼主不要恒压,用横流。

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2楼2012-07-20 08:41:31
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芯片妞妞

新虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-20 08:41:31
电流变小的可能原因是,
1. 你没有用循环水将胶板降温,因为再长时间的电泳下,胶板发热,导致电阻变大而电流变小。
2,你的电机缓冲液渗漏,页面无法覆盖胶的最上部
楼主可以考虑,1,加循环水降温胶板
       ...

谢谢您的建议!
我是在冰上跑的,效果应该和循环水差不多吧
电泳时用恒压还是恒流,是根据什么来选择的?
3楼2012-07-20 13:04:18
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 芯片妞妞 at 2012-07-20 13:04:18
谢谢您的建议!
我是在冰上跑的,效果应该和循环水差不多吧
电泳时用恒压还是恒流,是根据什么来选择的?...

你用的是什么电泳仪啊,无法设定横流哇?
冰上的话不能把整个胶板都降温把,也可以用长一点的导线把你的胶在4度冰箱内跑也是可以的。
4楼2012-07-20 14:46:33
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芯片妞妞

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-20 14:46:33
你用的是什么电泳仪啊,无法设定横流哇?
冰上的话不能把整个胶板都降温把,也可以用长一点的导线把你的胶在4度冰箱内跑也是可以的。...

我用的是北京百晶生物技术有限公司的BG-verMINI 迷你垂直电泳仪,应该能设定恒流的
大分子量的蛋白很难跑啊,都跑了那么长时间怎么就跑出那么一点点,我都没辙儿了!
5楼2012-07-20 16:08:41
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
芯片妞妞: 金币+10, 有帮助 2012-07-25 08:19:34
非变性胶的电泳,蛋白质的分离取决于其所带的电荷以及分子大小。此外,在正式点样电泳前,可以预电泳30-60分钟,一般变性的预电泳,但是也有报道非变性的也用预电泳。楼主,如果你的分子量确实太大,可以考虑加大电流或电压,在冰箱内电泳。此外,你的样品制备没有问题吧哈。例如你的样品所在提取液或者换缓冲液的ph等也可能影响迁移速度。

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6楼2012-07-20 17:06:52
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芯片妞妞

新虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-20 17:06:52
非变性胶的电泳,蛋白质的分离取决于其所带的电荷以及分子大小。此外,在正式点样电泳前,可以预电泳30-60分钟,一般变性的预电泳,但是也有报道非变性的也用预电泳。楼主,如果你的分子量确实太大,可以考虑加大电 ...

是的,我每次都预跑30分钟。CRP分子量是115KD
样品的缓冲液和电泳缓冲液的PH是一样的
我还有一个疑问:Loading agent 什么时候加?是和其他样品一起加入再共孵育,还是让样品先孵育好在上样之前再快速加入Loading agent ?这个会有影响不?
谢谢你!
7楼2012-07-21 10:40:11
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