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银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

以前一直做变性电泳，最近出现个问题，做纯化的时候某些蛋白怎么也出不去，而且显示分子量很大，在200KD以上。有人推荐做一次非变性看看。
问一下，非变性的条件怎么样，是不是就是配胶的时候有点差别？
非变性和分子量与电荷都有关系，怎么确定某个蛋白的具体位置呢？用marker么？

1楼 2011-02-23 09:07:31

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木虫之王 (文坛精英)

★ ★ ★
水云(金币+1): 2011-02-23 09:23:33
dhd997(金币+3): good 2011-02-23 09:46:51

非变性在配胶、buffer、loading buffer 中均不能有变性剂存在。在上样之前也不能煮。

我们跑非变性都是在纯度大于95%的情况下为了检测蛋白是不是有多聚。

2楼2011-02-23 09:20:39

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银虫 (小有名气)

引用回帖:

Originally posted by brightfuture01 at 2011-02-23 01:20:39:
非变性在配胶、buffer、loading buffer 中均不能有变性剂存在。在上样之前也不能煮。

我们跑非变性都是在纯度大于95%的情况下为了检测蛋白是不是有多聚。

恩，对，我们也考虑是不是有多聚体存在。
我看有些人用非变性做活性分析，那么我有个问题就是，在有电荷和分子量两个影响因素的情况下，怎么确定目的蛋白的位置呢？

3楼2011-02-23 09:23:26

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木虫之王 (文坛精英)

水云(金币+1): 2011-07-07 14:45:09

引用回帖:

Originally posted by 水云 at 2011-02-23 01:23:26:
恩，对，我们也考虑是不是有多聚体存在。
我看有些人用非变性做活性分析，那么我有个问题就是，在有电荷和分子量两个影响因素的情况下，怎么确定目的蛋白的位置呢？

呵呵，位置是无法确定的哦。只能通过目的蛋白的量和杂蛋白的量来看，毕竟95%都是你的目的蛋白嘛，条带自然会很粗。

4楼2011-02-23 11:46:50

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