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shiniyuanai

新虫 (小有名气)

[求助] 【求助】蛋白质非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

最近我一直在跑蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,已经试过很多次,还是跑不好。
    我的蛋白是pI为6.3~7.6的稻米蛋白,14kD~16kD,不止一种蛋白。参考王家政的蛋白技术手册,用的是10%的分离胶和5%的浓缩胶,电泳缓冲液的pH是8.8,冰浴电泳,但是跑出来的效果非常不好,条带如下,连浓缩胶里面都有条带,但是跑SDS-PAGE的时候是好的啊!!图片也贴在下面。

目标蛋白 SDS-PAGE.png



目标蛋白 Native-PAGE.png 脱色比较完全后在浓缩胶内能看到拖尾的条带。。。
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shiniyuanai

新虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡门旺角 at 2012-10-09 14:06:57
不懂帮顶!!

非常感谢你最真诚的支持!!!
9楼2012-10-09 21:55:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
shiniyuanai: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢,真是好人 2012-10-09 15:19:07
非变性电泳条件下,蛋白依靠的是本身的负电荷移动,比起普通的SDS-PAGE,跑起来要慢得多。而且如果样品浓度过高会引起聚合沉淀。从你的胶看来可能就是这种情况。你可以用一些较弱的非离子去垢剂(例如Triton X-100)增溶一下样品。不知道你跑非变性胶的目的,是做in gel活性染色还是只想要分开不同的蛋白呢?

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2012-10-09 14:53:18
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shiniyuanai

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-09 14:53:18
非变性电泳条件下,蛋白依靠的是本身的负电荷移动,比起普通的SDS-PAGE,跑起来要慢得多。而且如果样品浓度过高会引起聚合沉淀。从你的胶看来可能就是这种情况。你可以用一些较弱的非离子去垢剂(例如Triton X-100) ...

我有几点想说明一下。
1. 增溶的目的是什么呢??稀释样品??我的样品溶解性还是非常好的。
2. 我的目的是分开不同的蛋白,在SDS-PAGE中,由于分子量大小相近,分不开了。
3. 浓缩胶里也有条带是为什么呢??
4楼2012-10-09 15:25:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
4楼: Originally posted by shiniyuanai at 2012-10-09 15:25:05
我有几点想说明一下。
1. 增溶的目的是什么呢??稀释样品??我的样品溶解性还是非常好的。
2. 我的目的是分开不同的蛋白,在SDS-PAGE中,由于分子量大小相近,分不开了。
3. 浓缩胶里也有条带是为什么呢??...

增溶的目的是利用detergent包被在蛋白分子的表面,使他们不发生聚合沉淀。你的浓缩胶里面的条带大概是聚合沉淀的蛋白。由于发生聚合,分子量变大,无法进入分离胶。
5楼2012-10-09 15:35:12
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