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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR特异性问题求助
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我要吃西瓜

金虫 (初入文坛)

[求助] PCR特异性问题求助

如题，最近在做分子克隆，根据一段序列设计了引物，使用反转录出来的cDNA作为模板，但是结果一直很不理想
PCR特异性问题求助
做了一下温度梯度进行PCR，结果还是这样，求帮忙分析
一共是3对引物 marker使用的是DS2000

左右两边各位marker，中间每三个为一个温度，每个温度从左到右产物长度分别是400+，600+，200+

[ Last edited by 我要吃西瓜 on 2013-9-28 at 12:45 ]
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1楼 2013-09-28 12:41:03
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-09-29 10:14:13
我要吃西瓜: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-09-29 19:55:53
1.引物设计好要在NCBI的blast上检索特异性，看看能不能引起非特异扩增。如果非特异的片段和目的片段差异小而且同引物的匹配度高，则修改引物。（特异性不好，单靠调整PCR条件是不行的）。
2.600bp降低引物浓度，减少延伸时间电泳时间延长。400bp的退火温度降一点试试。200bp的温度左一，左二左右。然后胶回收目的带，稀释100到1000倍做模板，做二次PCR试试（突变率会高一些，循环数25左右）。
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5楼2013-09-29 09:04:53
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普通回帖

肃清华书

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-09-28 13:26:22
我要吃西瓜: 金币+1, 感谢回复 2013-09-28 22:12:51
感觉2号孔的温度应该是最适温，至于拖尾可能是buffer出什么问题了，或者操作不太对也有可能是cDNA不纯。
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2楼2013-09-28 13:25:54
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hl16010921

木虫 (正式写手)
LZ的引物blast结果如何，目的带多大呀？
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3楼2013-09-28 16:22:55
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我要吃西瓜

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-28 16:22:55
LZ的引物blast结果如何，目的带多大呀？

这个不太懂啊，刚刚开始做，求指导啊
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4楼2013-09-28 22:11:56
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我要吃西瓜

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-29 09:04:53
1.引物设计好要在NCBI的blast上检索特异性，看看能不能引起非特异扩增。如果非特异的片段和目的片段差异小而且同引物的匹配度高，则修改引物。（特异性不好，单靠调整PCR条件是不行的）。
2.600bp降低引物浓度，减 ...

谢谢哈，我先试一下
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6楼2013-09-29 09:11:37
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北极胖熊

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-29 15:24:46
我要吃西瓜: 金币+5, 谢谢 2013-09-29 19:56:03
首先,不知道DS2000的带的情况,如果第一道400是最强的那条带的话就胶回收最强的带,600那个如果引物和模板均无问题建议降低退火温度,还有尝试一下高保真
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7楼2013-09-29 15:13:42
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lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 17:07:49
我要吃西瓜: 金币+3, ★有帮助 2013-10-01 06:15:33
你的模板的genetic organization是多copy的repeat结构吗？怎么p出这么多带，不想仅仅是引物错配引起的啊。
还有，好像是存在多对引物啊，check it and good luck！
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需要金币
8楼2013-09-30 08:19:32
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ndsc

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 17:07:55
我要吃西瓜: 金币+3, ★有帮助 2013-10-01 06:16:22
我认为扩增成这样已经挺好了，你的目的是什么？？

肯定是得到目的片段啊，现在应该做的不是优化扩增体系，而是在现有的最好体系中回收目的片段。

有些时候做实验就是这样，有些本末倒置，回收好相应片段后回收纯化，浓度够的克隆或直接测序，不够的二扩一次接着克隆测序，效率很关键的，有结果才是最终目的，剩下的只是浮云。
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9楼2013-09-30 17:05:49
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我要吃西瓜: 金币+3, ★有帮助 2013-10-01 06:16:45
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-01 17:06:55
只要有目的条带，其它一律可以忽略掉。
如果没有目的条带
1. 做大范围的复性温度调整（我吧，嘿嘿一般直接到70度，比如我克隆的基因就比较变态，复性温度在69度）；
2. 把你能用的酶都试一遍，看能不能有目的条带
3. 都不行，那就直接重新设计引物。
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10楼2013-09-30 17:12:28
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