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我要吃西瓜

金虫 (初入文坛)

[求助] PCR特异性问题求助

如题,最近在做分子克隆,根据一段序列设计了引物,使用反转录出来的cDNA作为模板,但是结果一直很不理想
PCR特异性问题求助
做了一下温度梯度进行PCR,结果还是这样,求帮忙分析
一共是3对引物 marker使用的是DS2000

左右两边各位marker,中间每三个为一个温度,每个温度从左到右产物长度分别是400+,600+,200+

[ Last edited by 我要吃西瓜 on 2013-9-28 at 12:45 ]
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我要吃西瓜

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-29 09:04:53
1.引物设计好要在NCBI的blast上检索特异性,看看能不能引起非特异扩增。如果非特异的片段和目的片段差异小而且同引物的匹配度高,则修改引物。(特异性不好,单靠调整PCR条件是不行的)。
2.600bp降低引物浓度,减 ...

谢谢哈,我先试一下
6楼2013-09-29 09:11:37
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肃清华书

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-09-28 13:26:22
我要吃西瓜: 金币+1, 感谢回复 2013-09-28 22:12:51
感觉2号孔的温度应该是最适温,至于拖尾可能是buffer出什么问题了,或者操作不太对也有可能是cDNA不纯。
2楼2013-09-28 13:25:54
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hl16010921

木虫 (正式写手)

LZ的引物blast结果如何,目的带多大呀?
3楼2013-09-28 16:22:55
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我要吃西瓜

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-28 16:22:55
LZ的引物blast结果如何,目的带多大呀?

这个不太懂啊,刚刚开始做,求指导啊
4楼2013-09-28 22:11:56
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