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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR特异性问题求助
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我要吃西瓜

金虫 (初入文坛)

[求助] PCR特异性问题求助

如题，最近在做分子克隆，根据一段序列设计了引物，使用反转录出来的cDNA作为模板，但是结果一直很不理想
PCR特异性问题求助
做了一下温度梯度进行PCR，结果还是这样，求帮忙分析
一共是3对引物 marker使用的是DS2000

左右两边各位marker，中间每三个为一个温度，每个温度从左到右产物长度分别是400+，600+，200+

[ Last edited by 我要吃西瓜 on 2013-9-28 at 12:45 ]
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1楼 2013-09-28 12:41:03
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我要吃西瓜

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-28 16:22:55
LZ的引物blast结果如何，目的带多大呀？

这个不太懂啊，刚刚开始做，求指导啊
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4楼2013-09-28 22:11:56
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肃清华书

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-09-28 13:26:22
我要吃西瓜: 金币+1, 感谢回复 2013-09-28 22:12:51
感觉2号孔的温度应该是最适温，至于拖尾可能是buffer出什么问题了，或者操作不太对也有可能是cDNA不纯。
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2楼2013-09-28 13:25:54
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hl16010921

木虫 (正式写手)
LZ的引物blast结果如何，目的带多大呀？
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3楼2013-09-28 16:22:55
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-09-29 10:14:13
我要吃西瓜: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-09-29 19:55:53
1.引物设计好要在NCBI的blast上检索特异性，看看能不能引起非特异扩增。如果非特异的片段和目的片段差异小而且同引物的匹配度高，则修改引物。（特异性不好，单靠调整PCR条件是不行的）。
2.600bp降低引物浓度，减少延伸时间电泳时间延长。400bp的退火温度降一点试试。200bp的温度左一，左二左右。然后胶回收目的带，稀释100到1000倍做模板，做二次PCR试试（突变率会高一些，循环数25左右）。
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5楼2013-09-29 09:04:53
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