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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 相对荧光定量cDNA的问题
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thinkerboy

铁虫 (小有名气)

[求助] 相对荧光定量cDNA的问题

求问坛子里的各位大神，我做相对荧光定量，首先提组织RNA，然后反转录成cDNA，以cDNA做模板做荧光定量，我主要做不同组织里的目的基因的相对表达量，请问我在提各个组织RNA，反转录后，要不要将各个组织反转录的cDNA测一下浓度，然后将各个组织的cDNA浓度稀释调整到相同的浓度，作为模板做荧光定量。也就是说我需要调整一下RNA浓度再反转录，或者是统一一下各个组织的cDNA浓度再作模板吗。

[ Last edited by thinkerboy on 2013-7-26 at 21:10 ]
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1楼 2013-07-26 21:00:26
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biomed_fanyi

新虫 (初入文坛)
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-27 11:22:44
本帖内容被屏蔽
2楼2013-07-27 11:19:47
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
thinkerboy(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-27 21:44:44
你描述的这个其实就是不同sample之间互相比较时 “均一化”的概念:normalization。
而qPCR常用的均一化手段就是通过一个被认为在不同组织中表达量恒定的基因作为标杆，即内参基因，比如actin。
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3楼2013-07-27 19:43:15
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
thinkerboy(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-07-27 21:44:51
没有实质性必要，因为你有内参。但在反转录之前一定要测总RNA浓度，防止浓度过高，反转录酶不足导致反转录不完全！ Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
4楼2013-07-27 21:15:47
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 17:14:23
个人觉得要测RNA浓度，根据RNA浓度做逆转录。带上你的内参，就能相对定量啦
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5楼2013-07-28 19:21:30
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小乖_1990

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-29 10:04:01
我们一般是根据RNA的浓度来调整，先把RNA浓度调整一致，再反转录，这样出来的cDNA的浓度基本就一致了。
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走自己的路，让别人羡慕嫉妒恨去吧！！！
6楼2013-07-29 10:02:42
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东晨潇晓

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-27 09:54:28
我做半定量时，就是RNA测一次，然后调整。之后跟管家基因对比。
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7楼2013-09-27 09:26:34
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

反转录之前的RNA需要测一下浓度，然后取相同量的RNA进行逆转录，然后取相同量的“RNA”做Realtime，取相同量的RNA做，可以辅助判断实验的成败，理论上同量的RNA即使是不同样品，内参的Ct值是基本一样的，如果你的内参Ct值相差很大，说明你实验控制的不好
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2013-09-27 17:17:44
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zr281069

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

从你的实验要求来看 不需要 不同组织的相对表达主要还是看内参 多皆多 少皆少 都是呈比例关系的
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人物
9楼2013-09-27 17:22:07
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