应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量双峰的问题
111/2返回列表12下一页
查看: 4659  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

独孤蚕

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 荧光定量双峰的问题

在荧光定量实验过程中遇到一个问题，就是我们的家禽腿肌中提取的RNA样品，做荧光定量经常有双峰，有的就没有。不知道这个【双峰是由于什么产生的】。还有，双峰当中我们的目的产物是在前峰，后峰是非特异性片段，这个我们已经确认过了。现在的问题就是，这个【非特异的后峰对我们的定量结果有影响吗】？之前好像听人说过，非特异前峰对定量有影响，但后峰一般不碍事。不知道是不是这么一回事。具体的溶解曲线图见附件。
       恳请走过路过的大牛赐教一下啊！
荧光定量双峰的问题
56WKMMQT4$$Q`U9IV@)6ZTQ.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-07-02 10:58:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

寻梦377

铜虫 (小有名气)
★
独孤蚕(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-02 12:37:07
严格意义来讲，是有影响的，这样的数据不可用，因为一部分引物被用去非特异性扩增，相对于目的片段的引物浓度就小了。
解决方法，重新设计引物，可以用网页版的primer3 plus，提高退火温度，控制目的片段长度，100-150 bp为宜。
赞一下(1人) 回复此楼
善待身边的每个人！
2楼2013-07-02 12:11:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhouking8758

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-04 02:58:24
纠正楼主一点：定量PCR过程中，特异性产物峰之后的峰绝对有影响，而且影响很大，无法消除。产物前锋是可以通过调整荧光信号收集点的温度来消除的。
至于楼主不同胚龄产物峰图不一样，比较认同5楼的看法，是不是污染了DNA基因组，而且扩曾区域刚好跨了内含子？
在提取RNA过程中，可以通过DNase来消化基因组DNA，同时抽提过程中注意不要吸取到非水相产物。
如果还是排除不了，就需要重新设计引物。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2013-07-03 10:40:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
独孤蚕(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-02 12:37:20
你确定后面的峰是非特异片段还是样品RNA中污染了基因组DNA？非特异扩增肯定会影响定量，因为定量是通过荧光总量到达阈值时的循环数目来计算的，后面的峰也会产生荧光，直接影响定量，而且非特异扩增还会竞争引物，影响扩增效率。我觉得你的这对引物问题比较大，不仅后面有峰，而且产物峰前面还有个小峰，很可能是引物二聚体。我认为你需要重新设计引物。
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-02 12:29:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

独孤蚕

铁杆木虫 (著名写手)
内容已删除
回复此楼
4楼2013-07-02 13:44:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-03 02:12:56
独孤蚕: 金币+3, ★有帮助 2013-07-03 11:35:42
内容已删除
赞一下 回复此楼
5楼2013-07-02 23:59:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

独孤蚕

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhouking8758 at 2013-07-03 10:40:47
纠正楼主一点：定量PCR过程中，特异性产物峰之后的峰绝对有影响，而且影响很大，无法消除。产物前锋是可以通过调整荧光信号收集点的温度来消除的。
至于楼主不同胚龄产物峰图不一样，比较认同5楼的看法，是不是污染 ...

产物前锋调整收集点温度来消除，听起来可行。我们都是在退火步骤结束之后收集信号的，如果按照你的方法，是不是应该专门建立一个适当的温度点步骤来收集信号啊？
赞一下 回复此楼
7楼2013-07-03 11:38:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhouking8758

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 独孤蚕 at 2013-07-03 11:38:15
产物前锋调整收集点温度来消除，听起来可行。我们都是在退火步骤结束之后收集信号的，如果按照你的方法，是不是应该专门建立一个适当的温度点步骤来收集信号啊？...

一般是在产物峰开始起峰前一点的时候收集信号。
赞一下 回复此楼
8楼2013-07-03 16:10:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-04 02:58:43
引用回帖:
7楼: Originally posted by 独孤蚕 at 2013-07-03 11:38:15
产物前锋调整收集点温度来消除，听起来可行。我们都是在退火步骤结束之后收集信号的，如果按照你的方法，是不是应该专门建立一个适当的温度点步骤来收集信号啊？...

这个方法虽然说是可行的，但只是针对产物峰前有小峰（一般是引物二聚体）时采用的无可奈何之举。主要是产物形成后再升高温度把小峰熔解掉后读取荧光值。这样做无法避免的问题是PCR过程中形成引物二聚体时与主反应竞争引物，可能影响扩增效率。我觉得最好的办法还是换一对理想一点的引物。我做定量的引物一般都设计2对选其中好的一对用。
赞一下 回复此楼
9楼2013-07-03 23:27:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

独孤蚕

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 23:27:37
这个方法虽然说是可行的，但只是针对产物峰前有小峰（一般是引物二聚体）时采用的无可奈何之举。主要是产物形成后再升高温度把小峰熔解掉后读取荧光值。这样做无法避免的问题是PCR过程中形成引物二聚体时与主反应竞 ...

探讨一下理论问题啊。如果我做标曲，在有引物二聚体存在的情况下，扩增效率也是在95%-105%之间。虽然说引物二聚体影响扩增效率，但是目的基因扩增效率也达到了要求。这种结果是不是也可以接受呢？
赞一下 回复此楼
10楼2013-07-04 08:26:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 独孤蚕 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +37 医学老男孩 2026-08-13 86/4300 2026-08-18 00:18 by longsantaizi
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +8 wangze12014 2026-08-14 10/500 2026-08-17 17:05 by xter9665
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +4 基诺咪客 2026-08-17 4/200 2026-08-17 16:10 by Vivilian
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +12 Ldrop2023 2026-08-13 15/750 2026-08-17 15:02 by 小豌豆_发芽
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +13 archvillain 2026-08-15 25/1250 2026-08-16 20:13 by zhaosm1982
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 6/300 2026-08-16 20:07 by 奶牛小黑
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭