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独孤蚕

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 荧光定量双峰的问题

在荧光定量实验过程中遇到一个问题,就是我们的家禽腿肌中提取的RNA样品,做荧光定量经常有双峰,有的就没有。不知道这个【双峰是由于什么产生的】。还有,双峰当中我们的目的产物是在前峰,后峰是非特异性片段,这个我们已经确认过了。现在的问题就是,这个【非特异的后峰对我们的定量结果有影响吗】?之前好像听人说过,非特异前峰对定量有影响,但后峰一般不碍事。不知道是不是这么一回事。具体的溶解曲线图见附件。
       恳请走过路过的大牛赐教一下啊!
荧光定量双峰的问题
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-04 02:58:43
引用回帖:
7楼: Originally posted by 独孤蚕 at 2013-07-03 11:38:15
产物前锋调整收集点温度来消除,听起来可行。我们都是在退火步骤结束之后收集信号的,如果按照你的方法,是不是应该专门建立一个适当的温度点步骤来收集信号啊?...

这个方法虽然说是可行的,但只是针对产物峰前有小峰(一般是引物二聚体)时采用的无可奈何之举。主要是产物形成后再升高温度把小峰熔解掉后读取荧光值。这样做无法避免的问题是PCR过程中形成引物二聚体时与主反应竞争引物,可能影响扩增效率。我觉得最好的办法还是换一对理想一点的引物。我做定量的引物一般都设计2对选其中好的一对用。
9楼2013-07-03 23:27:37
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查看全部 11 个回答

寻梦377

铜虫 (小有名气)


独孤蚕(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-02 12:37:07
严格意义来讲,是有影响的,这样的数据不可用,因为一部分引物被用去非特异性扩增,相对于目的片段的引物浓度就小了。
解决方法,重新设计引物,可以用网页版的primer3 plus,提高退火温度,控制目的片段长度,100-150 bp为宜。
善待身边的每个人!
2楼2013-07-02 12:11:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
独孤蚕(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-02 12:37:20
你确定后面的峰是非特异片段还是样品RNA中污染了基因组DNA?非特异扩增肯定会影响定量,因为定量是通过荧光总量到达阈值时的循环数目来计算的,后面的峰也会产生荧光,直接影响定量,而且非特异扩增还会竞争引物,影响扩增效率。我觉得你的这对引物问题比较大,不仅后面有峰,而且产物峰前面还有个小峰,很可能是引物二聚体。我认为你需要重新设计引物。
3楼2013-07-02 12:29:02
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zhouking8758

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-04 02:58:24
纠正楼主一点:定量PCR过程中,特异性产物峰之后的峰绝对有影响,而且影响很大,无法消除。产物前锋是可以通过调整荧光信号收集点的温度来消除的。
至于楼主不同胚龄产物峰图不一样,比较认同5楼的看法,是不是污染了DNA基因组,而且扩曾区域刚好跨了内含子?
在提取RNA过程中,可以通过DNase来消化基因组DNA,同时抽提过程中注意不要吸取到非水相产物。
如果还是排除不了,就需要重新设计引物。
6楼2013-07-03 10:40:47
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