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独孤蚕

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 荧光定量双峰的问题

在荧光定量实验过程中遇到一个问题,就是我们的家禽腿肌中提取的RNA样品,做荧光定量经常有双峰,有的就没有。不知道这个【双峰是由于什么产生的】。还有,双峰当中我们的目的产物是在前峰,后峰是非特异性片段,这个我们已经确认过了。现在的问题就是,这个【非特异的后峰对我们的定量结果有影响吗】?之前好像听人说过,非特异前峰对定量有影响,但后峰一般不碍事。不知道是不是这么一回事。具体的溶解曲线图见附件。
       恳请走过路过的大牛赐教一下啊!
荧光定量双峰的问题
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寻梦377

铜虫 (小有名气)


独孤蚕(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-02 12:37:07
严格意义来讲,是有影响的,这样的数据不可用,因为一部分引物被用去非特异性扩增,相对于目的片段的引物浓度就小了。
解决方法,重新设计引物,可以用网页版的primer3 plus,提高退火温度,控制目的片段长度,100-150 bp为宜。
善待身边的每个人!
2楼2013-07-02 12:11:10
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