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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 再次求助——蛋白纯化结果
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] 再次求助——蛋白纯化结果

感谢大家上次对我的实验指导，听从意见，换了离子交换树脂，改成了Capto adhere，没怎么看文献就先做了一次实验，请大家帮忙分析结果及指正啊，谢谢了
上样是10ml，蛋白含量大概1.5mg左右，柱子是1ml的预装柱。缓冲液是50mM Tris，pH6.0，洗脱用1M NaCl。上柱发现目的蛋白流穿，洗脱时候只有很弱的峰，检测了还是还有目的蛋白。我看这种填料的是吸附杂蛋白和DNA的。我检测了一下，发现DNA去除效果很差。我该用什么条件继续摸索呢？我自己是打算改缓冲液的pH值，看下能不能让蛋白挂柱，请问可行不？
再次求助——蛋白纯化结果
1.jpg

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-24 at 09:26 ]
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你的日子如何，你的力量也必如何！
1楼 2013-07-23 15:47:21
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-24 09:02:53
目前来看ph是你唯一可以改变的条件
所以可以选择改变它试一试，不过之间你要先了解一下你的蛋白pi
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修身、齐家、治国、平天下
2楼2013-07-23 20:16:06
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-23 22:21:04
sxxuan: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-24 09:13:01
“上柱发现目的蛋白流穿，洗脱时候只有很弱的峰，检测了还是还有目的蛋白”
你可以尝试一下pH了，就像楼上说的，了解一下你的蛋白的PI比较有必要。
同样的pH，也有很多种的buffer来选择，并且binding buffer的盐浓度也是可以尝试的，下次跑的时候多平衡一下你的柱子试试。
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3楼2013-07-23 21:19:30
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-07-24 09:12:07
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-24 11:24:30
本帖内容被屏蔽
4楼2013-07-24 08:33:14
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by alicelchf at 2013-07-23 20:16:06
目前来看ph是你唯一可以改变的条件
所以可以选择改变它试一试，不过之间你要先了解一下你的蛋白pi

之前试过用Q的柱子来试，pH8的时候部分流穿部分挂柱，pH10的时候全部挂柱了
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你的日子如何，你的力量也必如何！
5楼2013-07-24 09:03:59
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by danbomingyue at 2013-07-24 08:33:14
目的蛋白大部分流穿，洗脱有微弱的峰，表明你的填料能够吸附目的蛋白，但是你的上样pH条件处于一个介于挂柱和穿出之间，建议根据你的目的蛋白的pI，调整上样pH。另外Tris-HCl在pH6.0时的缓冲能力很弱，如果pH上调， ...

明白，我看看有没有醋酸钠，我看有些人都是用醋酸钠的，可以不？
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你的日子如何，你的力量也必如何！
6楼2013-07-24 09:11:59
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lwiaanngg at 2013-07-23 21:19:30
“上柱发现目的蛋白流穿，洗脱时候只有很弱的峰，检测了还是还有目的蛋白”
你可以尝试一下pH了，就像楼上说的，了解一下你的蛋白的PI比较有必要。
同样的pH，也有很多种的buffer来选择，并且binding buffer的盐浓 ...

一般来说buffer会选用什么？
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你的日子如何，你的力量也必如何！
7楼2013-07-24 09:12:55
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
★ ★
sxxuan: 金币+2, ★有帮助 2013-07-24 13:38:08
本帖内容被屏蔽
8楼2013-07-24 10:13:41
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by danbomingyue at 2013-07-24 10:13:41
buffer的选择一般是首先考虑你的pI，确定了PI之后buffer就很好选择了。
...

好的，谢谢
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你的日子如何，你的力量也必如何！
9楼2013-07-24 13:37:56
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
sxxuan: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-26 09:04:29
引用回帖:
7楼: Originally posted by sxxuan at 2013-07-24 09:12:55
一般来说buffer会选用什么？...

没有一般来说用什么，关键是你想要什么pH了，并且考虑一下哪些buffer对你的蛋白有副作用了
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10楼2013-07-25 21:00:21
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