应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 巢式PCR问题
161/2返回列表12下一页
查看: 1796  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

[求助] 巢式PCR问题

请高手指教：我做巢式PCR做了一周多了，第一轮一直没有东西，第二轮也没有东西。（用特异性引物可以扩增出来，说明模板没问题）。退火温度和模板梯度都做了，但是还是不行。可能原因有哪些呢？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-05-16 22:38:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by study韩 at 2013-05-17 23:32:25
请问下楼主，为什么这个PCR体系和平时经常用的PCR体系不一样？...

这个反应体系就是TARAKA的Ex Taq啊，只是模板多了一些，因为我的浓度比较低。做的巢式PCR，兼并引物，用来构建克隆文库。
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2013-05-18 08:42:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

张文萱

新虫 (初入文坛)
★
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-17 17:11:04
从引物互补关系方面下功夫
赞一下 回复此楼
2楼2013-05-17 16:24:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张文萱 at 2013-05-17 16:24:38
从引物互补关系方面下功夫

引物是文献中的经典引物，以前别人用此引物可以P出来的。
赞一下 回复此楼
3楼2013-05-17 16:35:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-17 17:11:16
楼主再多给些信息吧, 目标产物大小? 什么酶? 程序? 循环数? 跑胶有没有发现很多的引物二聚体? ...你描述的越详细大家才越容易分析.
赞一下 回复此楼
4楼2013-05-17 16:58:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-17 16:58:36
楼主再多给些信息吧, 目标产物大小? 什么酶? 程序? 循环数? 跑胶有没有发现很多的引物二聚体? ...你描述的越详细大家才越容易分析.

模板:   海水总DNA，20ng/ul  （用物种特异性引物，分别能扩增出来约80bp，所以默认为模板是可以的，一个月前提取的DNA）
引物：文献中经典引物，不是本人设计，有人做出来，经过验证时可以的
反应条件：退火温度57,55,50度都尝试过，都没有扩增出来
第一轮引物预期扩增460bp，第二轮预期扩增260bp

预变性94度   4min
94度    1min
57/55/50度    1min
72度    1min       反应做25个循环。
72度   7min

反应试剂盒：TAKARA  Ex  Tap酶  
Ex Taq  酶  0.25ul
10*buffer    5ul
dNTP（2.5Mm） 4ul
模板            5ul
引物 1和2 （浓度20uM)    各1ul
灭菌水      
           总反应体系50ul
赞一下 回复此楼
5楼2013-05-17 17:26:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-21 00:50:11
引用回帖:
5楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-05-17 17:26:37
模板:   海水总DNA，20ng/ul  （用物种特异性引物，分别能扩增出来约80bp，所以默认为模板是可以的，一个月前提取的DNA）
引物：文献中经典引物，不是本人设计，有人做出来，经过验证时可以的
反应条件：退火温度 ...

一些建议:
目标产物是否GC含量过高, 如果是的话可以先加4%(终浓度)DMSO,
两轮PCR不妨各增加5个循环,
72度扩增的时间可以缩短至30秒,
有没有可能你采的海水样品里面没有这个物种?
另外从节省的角度考虑, 楼主的反应体系可以做20, 甚至是10微升的.
赞一下 回复此楼
6楼2013-05-17 17:56:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-17 17:56:36
一些建议:
目标产物是否GC含量过高, 如果是的话可以先加4%(终浓度)DMSO,
两轮PCR不妨各增加5个循环,
72度扩增的时间可以缩短至30秒,
有没有可能你采的海水样品里面没有这个物种?
另外从节省的角度考虑, 楼主 ...

多谢您的建议，产物GC含量不是太高。样品里面是有这个物种的，因为我用做QPCR的特异性引物扩增是可以扩增出来的（用的是同一个酶和反应体系）。我明天按照您的建议试试！
赞一下 回复此楼
7楼2013-05-17 21:08:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

study韩

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-05-17 17:26:37
模板:   海水总DNA，20ng/ul  （用物种特异性引物，分别能扩增出来约80bp，所以默认为模板是可以的，一个月前提取的DNA）
引物：文献中经典引物，不是本人设计，有人做出来，经过验证时可以的
反应条件：退火温度 ...

请问下楼主，为什么这个PCR体系和平时经常用的PCR体系不一样？
赞一下 回复此楼
8楼2013-05-17 23:32:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-21 00:50:31
第一轮可以用梯度，从65度开始退火，每个循环下降0.7度，（我一般用0.7度）30个循环，然后第二轮再用正常的退火温度，根据你的GC含量设置退火温度试试.
赞一下 回复此楼
10楼2013-05-18 15:34:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 ljx2ljx 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-31 00:21 by hZiFeudZyoGR
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 4FFAWE8HcgUD 2026-08-29 5/250 2026-08-30 20:41 by hZiFeudZyoGR
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 zICmwzsBXjbN 2026-08-29 5/250 2026-08-30 20:08 by hZiFeudZyoGR
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 6/300 2026-08-30 19:13 by hZiFeudZyoGR
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 4/200 2026-08-30 18:53 by hZiFeudZyoGR
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 18:17 by hZiFeudZyoGR
[基金申请] 面上意见出来了 +9 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 18/900 2026-08-30 16:47 by 黄鸟于飞Chao
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 8/400 2026-08-30 12:03 by l0VvVHGBGRLv
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-30 06:10 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +4 349506619 2026-08-28 4/200 2026-08-29 22:41 by alongwaytogo
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 基金不中，共勉 +11 eulota 2026-08-26 11/550 2026-08-28 14:22 by 火星超人xi
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭