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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

[求助] 巢式PCR问题

请高手指教:我做巢式PCR做了一周多了,第一轮一直没有东西,第二轮也没有东西。(用特异性引物可以扩增出来,说明模板没问题)。退火温度和模板梯度都做了,但是还是不行。可能原因有哪些呢?
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-21 00:50:11
引用回帖:
5楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-05-17 17:26:37
模板:   海水总DNA,20ng/ul  (用物种特异性引物,分别能扩增出来约80bp,所以默认为模板是可以的,一个月前提取的DNA)
引物:文献中经典引物,不是本人设计,有人做出来,经过验证时可以的
反应条件:退火温度 ...

一些建议:
目标产物是否GC含量过高, 如果是的话可以先加4%(终浓度)DMSO,
两轮PCR不妨各增加5个循环,
72度扩增的时间可以缩短至30秒,
有没有可能你采的海水样品里面没有这个物种?
另外从节省的角度考虑, 楼主的反应体系可以做20, 甚至是10微升的.
6楼2013-05-17 17:56:36
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张文萱

新虫 (初入文坛)


ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-17 17:11:04
从引物互补关系方面下功夫
2楼2013-05-17 16:24:38
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 张文萱 at 2013-05-17 16:24:38
从引物互补关系方面下功夫

引物是文献中的经典引物,以前别人用此引物可以P出来的。
3楼2013-05-17 16:35:22
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-17 17:11:16
楼主再多给些信息吧, 目标产物大小? 什么酶? 程序? 循环数? 跑胶有没有发现很多的引物二聚体? ...你描述的越详细大家才越容易分析.
4楼2013-05-17 16:58:36
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