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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

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[求助] 巢式PCR问题

请高手指教：我做巢式PCR做了一周多了，第一轮一直没有东西，第二轮也没有东西。（用特异性引物可以扩增出来，说明模板没问题）。退火温度和模板梯度都做了，但是还是不行。可能原因有哪些呢？

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1楼 2013-05-16 22:38:49

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bullfrog325

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-21 00:50:11

引用回帖:

5楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-05-17 17:26:37
模板: 海水总DNA，20ng/ul （用物种特异性引物，分别能扩增出来约80bp，所以默认为模板是可以的，一个月前提取的DNA）
引物：文献中经典引物，不是本人设计，有人做出来，经过验证时可以的
反应条件：退火温度 ...

一些建议:
目标产物是否GC含量过高, 如果是的话可以先加4%(终浓度)DMSO,
两轮PCR不妨各增加5个循环,
72度扩增的时间可以缩短至30秒,
有没有可能你采的海水样品里面没有这个物种?
另外从节省的角度考虑, 楼主的反应体系可以做20, 甚至是10微升的.