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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 巢式PCR问题
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

[求助] 巢式PCR问题

请高手指教：我做巢式PCR做了一周多了，第一轮一直没有东西，第二轮也没有东西。（用特异性引物可以扩增出来，说明模板没问题）。退火温度和模板梯度都做了，但是还是不行。可能原因有哪些呢？
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1楼 2013-05-16 22:38:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by study韩 at 2013-05-17 23:32:25
请问下楼主，为什么这个PCR体系和平时经常用的PCR体系不一样？...

这个反应体系就是TARAKA的Ex Taq啊，只是模板多了一些，因为我的浓度比较低。做的巢式PCR，兼并引物，用来构建克隆文库。
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9楼2013-05-18 08:42:56
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普通回帖

张文萱

新虫 (初入文坛)
★
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-17 17:11:04
从引物互补关系方面下功夫
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2楼2013-05-17 16:24:38
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张文萱 at 2013-05-17 16:24:38
从引物互补关系方面下功夫

引物是文献中的经典引物，以前别人用此引物可以P出来的。
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3楼2013-05-17 16:35:22
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-17 17:11:16
楼主再多给些信息吧, 目标产物大小? 什么酶? 程序? 循环数? 跑胶有没有发现很多的引物二聚体? ...你描述的越详细大家才越容易分析.
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4楼2013-05-17 16:58:36
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-17 16:58:36
楼主再多给些信息吧, 目标产物大小? 什么酶? 程序? 循环数? 跑胶有没有发现很多的引物二聚体? ...你描述的越详细大家才越容易分析.

模板:   海水总DNA，20ng/ul  （用物种特异性引物，分别能扩增出来约80bp，所以默认为模板是可以的，一个月前提取的DNA）
引物：文献中经典引物，不是本人设计，有人做出来，经过验证时可以的
反应条件：退火温度57,55,50度都尝试过，都没有扩增出来
第一轮引物预期扩增460bp，第二轮预期扩增260bp

预变性94度   4min
94度    1min
57/55/50度    1min
72度    1min       反应做25个循环。
72度   7min

反应试剂盒：TAKARA  Ex  Tap酶  
Ex Taq  酶  0.25ul
10*buffer    5ul
dNTP（2.5Mm） 4ul
模板            5ul
引物 1和2 （浓度20uM)    各1ul
灭菌水      
           总反应体系50ul
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5楼2013-05-17 17:26:37
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-21 00:50:11
引用回帖:
5楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-05-17 17:26:37
模板:   海水总DNA，20ng/ul  （用物种特异性引物，分别能扩增出来约80bp，所以默认为模板是可以的，一个月前提取的DNA）
引物：文献中经典引物，不是本人设计，有人做出来，经过验证时可以的
反应条件：退火温度 ...

一些建议:
目标产物是否GC含量过高, 如果是的话可以先加4%(终浓度)DMSO,
两轮PCR不妨各增加5个循环,
72度扩增的时间可以缩短至30秒,
有没有可能你采的海水样品里面没有这个物种?
另外从节省的角度考虑, 楼主的反应体系可以做20, 甚至是10微升的.
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6楼2013-05-17 17:56:36
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-17 17:56:36
一些建议:
目标产物是否GC含量过高, 如果是的话可以先加4%(终浓度)DMSO,
两轮PCR不妨各增加5个循环,
72度扩增的时间可以缩短至30秒,
有没有可能你采的海水样品里面没有这个物种?
另外从节省的角度考虑, 楼主 ...

多谢您的建议，产物GC含量不是太高。样品里面是有这个物种的，因为我用做QPCR的特异性引物扩增是可以扩增出来的（用的是同一个酶和反应体系）。我明天按照您的建议试试！
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7楼2013-05-17 21:08:06
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study韩

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-05-17 17:26:37
模板:   海水总DNA，20ng/ul  （用物种特异性引物，分别能扩增出来约80bp，所以默认为模板是可以的，一个月前提取的DNA）
引物：文献中经典引物，不是本人设计，有人做出来，经过验证时可以的
反应条件：退火温度 ...

请问下楼主，为什么这个PCR体系和平时经常用的PCR体系不一样？
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8楼2013-05-17 23:32:25
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三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-21 00:50:31
第一轮可以用梯度，从65度开始退火，每个循环下降0.7度，（我一般用0.7度）30个循环，然后第二轮再用正常的退火温度，根据你的GC含量设置退火温度试试.
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10楼2013-05-18 15:34:10
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