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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

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[求助] 巢式PCR问题

请高手指教：我做巢式PCR做了一周多了，第一轮一直没有东西，第二轮也没有东西。（用特异性引物可以扩增出来，说明模板没问题）。退火温度和模板梯度都做了，但是还是不行。可能原因有哪些呢？

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1楼 2013-05-16 22:38:49

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引用回帖:

4楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-17 16:58:36
楼主再多给些信息吧, 目标产物大小? 什么酶? 程序? 循环数? 跑胶有没有发现很多的引物二聚体? ...你描述的越详细大家才越容易分析.

模板: 海水总DNA，20ng/ul  （用物种特异性引物，分别能扩增出来约80bp，所以默认为模板是可以的，一个月前提取的DNA）
引物：文献中经典引物，不是本人设计，有人做出来，经过验证时可以的
反应条件：退火温度57,55,50度都尝试过，都没有扩增出来
第一轮引物预期扩增460bp，第二轮预期扩增260bp

预变性94度 4min
94度 1min
57/55/50度 1min
72度 1min    反应做25个循环。
72度 7min

反应试剂盒：TAKARA  Ex  Tap酶
Ex Taq  酶  0.25ul
10*buffer 5ul
dNTP（2.5Mm） 4ul
模板          5ul
引物 1和2 （浓度20uM) 各1ul
灭菌水
         总反应体系50ul