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巢式PCR问题
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| 请高手指教：我做巢式PCR做了一周多了，第一轮一直没有东西，第二轮也没有东西。（用特异性引物可以扩增出来，说明模板没问题）。退火温度和模板梯度都做了，但是还是不行。可能原因有哪些呢？ |
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bullfrog325
木虫 (正式写手)
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4楼2013-05-17 16:58:36
2楼2013-05-17 16:24:38
3楼2013-05-17 16:35:22
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模板: 海水总DNA，20ng/ul （用物种特异性引物，分别能扩增出来约80bp，所以默认为模板是可以的，一个月前提取的DNA） 引物：文献中经典引物，不是本人设计，有人做出来，经过验证时可以的 反应条件：退火温度57,55,50度都尝试过，都没有扩增出来 第一轮引物预期扩增460bp，第二轮预期扩增260bp 预变性94度 4min 94度 1min 57/55/50度 1min 72度 1min 反应做25个循环。 72度 7min 反应试剂盒：TAKARA Ex Tap酶 Ex Taq 酶 0.25ul 10*buffer 5ul dNTP（2.5Mm） 4ul 模板 5ul 引物 1和2 （浓度20uM) 各1ul 灭菌水 总反应体系50ul |
5楼2013-05-17 17:26:37
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30