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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

[求助] 巢式PCR问题

请高手指教:我做巢式PCR做了一周多了,第一轮一直没有东西,第二轮也没有东西。(用特异性引物可以扩增出来,说明模板没问题)。退火温度和模板梯度都做了,但是还是不行。可能原因有哪些呢?
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-17 17:56:36
一些建议:
目标产物是否GC含量过高, 如果是的话可以先加4%(终浓度)DMSO,
两轮PCR不妨各增加5个循环,
72度扩增的时间可以缩短至30秒,
有没有可能你采的海水样品里面没有这个物种?
另外从节省的角度考虑, 楼主 ...

多谢您的建议,产物GC含量不是太高。样品里面是有这个物种的,因为我用做QPCR的特异性引物扩增是可以扩增出来的(用的是同一个酶和反应体系)。我明天按照您的建议试试!
7楼2013-05-17 21:08:06
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张文萱

新虫 (初入文坛)


ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-17 17:11:04
从引物互补关系方面下功夫
2楼2013-05-17 16:24:38
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 张文萱 at 2013-05-17 16:24:38
从引物互补关系方面下功夫

引物是文献中的经典引物,以前别人用此引物可以P出来的。
3楼2013-05-17 16:35:22
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
ljx2ljx(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-17 17:11:16
楼主再多给些信息吧, 目标产物大小? 什么酶? 程序? 循环数? 跑胶有没有发现很多的引物二聚体? ...你描述的越详细大家才越容易分析.
4楼2013-05-17 16:58:36
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