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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 巢式PCR问题
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2013-05-18 15:34:10
第一轮可以用梯度，从65度开始退火，每个循环下降0.7度，（我一般用0.7度）30个循环，然后第二轮再用正常的退火温度，根据你的GC含量设置退火温度试试.

您好，温度梯度我做过了，从57度到52度，每个梯度1度，但是还是不行，要崩溃了。以前怀疑引物有问题，生工的引物，重新合成后还是这样，别人说巢式很容易做，为什么我做不下去了呢？？？
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11楼2013-05-20 21:29:04
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三撇五撇

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-05-20 21:29:04
您好，温度梯度我做过了，从57度到52度，每个梯度1度，但是还是不行，要崩溃了。以前怀疑引物有问题，生工的引物，重新合成后还是这样，别人说巢式很容易做，为什么我做不下去了呢？？？...

试试两步法？
95   3min
98   12s
68   20s+延伸时间
72  5min
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12楼2013-05-21 09:09:51
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孤城一片

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

巢氏PCR第一轮应该是有东西的，只是是弥散的，假如相当干净，就是做第二轮，没模板怎么会有结果呢
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本意探花郎，奈何芷若香；寄意予青陆，共沐好蟾光。
13楼2013-05-21 14:11:06
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 孤城一片 at 2013-05-21 14:11:06
巢氏PCR第一轮应该是有东西的，只是是弥散的，假如相当干净，就是做第二轮，没模板怎么会有结果呢

那么像我这种情况究竟是什么原因呢，我的引物设计是没有问题的，退火温度梯度也做过了，我用左QPCR的引物可以特异性扩增（P了两个类群都出来了），反而这个兼并引物扩增出来的搞不定，请您赐教！！！
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14楼2013-05-21 14:17:17
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2013-05-21 09:09:51
试试两步法？
95   3min
98   12s
68   20s+延伸时间
72  5min...

现在引物又重新再鼎国合成，明天到。再试试，不行的话就崩溃了，
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15楼2013-05-21 14:18:25
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
问题已经得到解决，我换了另一家的试剂盒就可以扩增出来了，多谢各位！
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16楼2013-05-25 09:18:37
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