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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序结果很奇怪
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longyh6411

金虫 (小有名气)

[求助] 测序结果很奇怪

我用A和B是同一物种，该物种的基因组数据早就出来了，而且是用A测得的。A和B在我研究的性状上有很大不同。我P了A和B的与这个形状相关的一个相关基因，片段不大，只有590bp，但是奇怪的事出来了，在3‘的(下游引物结合区域内,而且在做PCR的时候A和B用的是统一管引物)端A和B序列有l两个碱基比对不上，而且A和数据库也比对不上，有一个碱基的缺失另外一个碱基的突变。更关键的就是A的序列这个与B比对不上的碱基形成了终止密码子。也就是说和数据库相比终止密码子出现的提前了，也就导致了最后好几个氨基酸的缺失。
请问这是否是由于下游引物有问题呢还是可能是本身的突变?590单向测序可靠不？以前测了很多序列都没出现这样的问题，求高手帮忙
我只做了正向测序，测序是用的PCR产物

[ Last edited by longyh6411 on 2013-2-1 at 18:33 ]
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1楼2013-02-01 18:22:39
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chiden

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-02-01 21:13:08
在此想请问一个问题，楼主在扩增这个相关基因时设计的引物是刚好从起始密码子或终止密码子设计的？
在我们实验室，一般认为测序结果中前面80-100bp的测序结果是不准确的。不知道楼主那里的测序是不是从第一个碱基到最后一个碱基都保证是准确的？
遇到这样的问题，应该先去查一查测序结果中的ABI文件中碱基读取峰图。
看楼主上面说的似乎没有查证过。
如果峰型很好，说明测序公司给你的测序结果是准确的。
那么考虑是否真的发生了突变？
一般来说590bp一个反应足够了
还有要考虑的是PCR扩增的过程中是有一定的几率错配的
希望能帮到楼主吧，知道的也就这么多啦。。。
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即使难过，也要微笑着走下去
2楼2013-02-01 20:15:50
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longyh6411

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chiden at 2013-02-01 20:15:50
在此想请问一个问题，楼主在扩增这个相关基因时设计的引物是刚好从起始密码子或终止密码子设计的？
在我们实验室，一般认为测序结果中前面80-100bp的测序结果是不准确的。不知道楼主那里的测序是不是从第一个碱基到 ...

首先谢谢您的回复。这是测序的峰图，出现问题的地方不是特别好，您帮我看看吧。还有就是是按照起始密码子和终止密码子设计的，问题出现在3'端，测序是正向测序的，所以不在测序开始的100bp以内。还有就是这是PCR产物测序，PCR造成的突变影响比较微弱

捕获.PNG
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3楼2013-02-01 21:51:24
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runying36

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
LZ说A和B的不同是在下游引物结合区内，那有可能是两条引物在合成的时候就有一条是错的呗。如果这段序列很重要，应该在这段之后设计引物来确定这段的真实序列。
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4楼2013-02-01 22:03:43
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longyh6411

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by runying36 at 2013-02-01 22:03:43
LZ说A和B的不同是在下游引物结合区内，那有可能是两条引物在合成的时候就有一条是错的呗。如果这段序列很重要，应该在这段之后设计引物来确定这段的真实序列。

A和B用的是同一对引物，而且都是出现在下游引物的结合位点上，测序是正向的。从新设计引物的话就得下学期了，我像现在尽量弄明白些
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5楼2013-02-01 22:22:29
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runying36

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
longyh6411: 金币+50, ★★★很有帮助, 我也比较倾向于引物的问题，谢谢大家的解答 2013-02-03 10:39:41
你发给引物合成公司的序列是一样的，但是即使是同一管引物也包含了无数的寡核苷酸链分子，合成中不管是哪一种纯化方式都无法保证所有的寡核苷酸分子是完全和你所发的序列是一样的，就是有那么一些分子是有差错的，所以这种不同正巧出现在你的两次PCR中，其实即使是同一次PCR的不同克隆也很有可能会出现这种情况，原因就在于那一管引物粉末中不是所有的引物分子都是完全忠实于你所发的引物序列。
    请LZ仔细分析下你的问题会不会是这种情况。如果是这样的话，必须重新设计更下游的引物来得到这一段的真实序列，因为拿这一段来设计引物测序得到的都只能是引物自己的序列。
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6楼2013-02-01 23:16:25
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rola

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做一个反向测序就可以了，如果反向测序结果与正向的在碱基读取峰图的可信区间完全相符，那说明你的PCR产物在这里发生了缺失——这种情况我也遇到过，很无缘无故。
如果反向测序没有缺失而正向有，那有可能是正向测序的问题，需要多次测序加以验证。
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rola
7楼2013-02-02 10:58:41
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匿名

用户注销 (正式写手)
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8楼2013-02-02 17:03:25
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137167741

至尊木虫 (著名写手)
第一、可以双向测通验证一下；
第二、重新PCR一下，测序送两到三个平行样品备测或者同时测，以防出现类似的不好解释的情况或者现象；
第三、如果想弄清楚，可以重新设计新的引物，扩增片段大一些，把这590bp包括在内，在引物结合区是很容易出现问题的，一般来说引物是强制配对的。
实验顺利！！
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总有一天我要修改用户名。
9楼2013-02-04 11:51:08
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