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longyh6411

金虫 (小有名气)

[求助] 测序结果很奇怪

我用A和B是同一物种,该物种的基因组数据早就出来了,而且是用A测得的。A和B在我研究的性状上有很大不同。我P了A和B的与这个形状相关的一个相关基因,片段不大,只有590bp,但是奇怪的事出来了,在3‘的(下游引物结合区域内,而且在做PCR的时候A和B用的是统一管引物)端A和B序列有l两个碱基比对不上,而且A和数据库也比对不上,有一个碱基的缺失另外一个碱基的突变。更关键的就是A的序列这个与B比对不上的碱基形成了终止密码子。也就是说和数据库相比终止密码子出现的提前了,也就导致了最后好几个氨基酸的缺失。
请问这是否是由于下游引物有问题呢还是可能是本身的突变?590单向测序可靠不?以前测了很多序列都没出现这样的问题,求高手帮忙
我只做了正向测序,测序是用的PCR产物

[ Last edited by longyh6411 on 2013-2-1 at 18:33 ]
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

第一、可以双向测通验证一下;
第二、重新PCR一下,测序送两到三个平行样品备测或者同时测,以防出现类似的不好解释的情况或者现象;
第三、如果想弄清楚,可以重新设计新的引物,扩增片段大一些,把这590bp包括在内,在引物结合区是很容易出现问题的,一般来说引物是强制配对的。
实验顺利!!
总有一天我要修改用户名。
9楼2013-02-04 11:51:08
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