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测序结果很奇怪
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我用A和B是同一物种，该物种的基因组数据早就出来了，而且是用A测得的。A和B在我研究的性状上有很大不同。我P了A和B的与这个形状相关的一个相关基因，片段不大，只有590bp，但是奇怪的事出来了，在3‘的(下游引物结合区域内,而且在做PCR的时候A和B用的是统一管引物)端A和B序列有l两个碱基比对不上，而且A和数据库也比对不上，有一个碱基的缺失另外一个碱基的突变。更关键的就是A的序列这个与B比对不上的碱基形成了终止密码子。也就是说和数据库相比终止密码子出现的提前了，也就导致了最后好几个氨基酸的缺失。 请问这是否是由于下游引物有问题呢还是可能是本身的突变?590单向测序可靠不？以前测了很多序列都没出现这样的问题，求高手帮忙 我只做了正向测序，测序是用的PCR产物 [ Last edited by longyh6411 on 2013-2-1 at 18:33 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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longyh6411: 金币+50, ★★★很有帮助, 我也比较倾向于引物的问题，谢谢大家的解答 2013-02-03 10:39:41
longyh6411: 金币+50, ★★★很有帮助, 我也比较倾向于引物的问题，谢谢大家的解答 2013-02-03 10:39:41
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你发给引物合成公司的序列是一样的，但是即使是同一管引物也包含了无数的寡核苷酸链分子，合成中不管是哪一种纯化方式都无法保证所有的寡核苷酸分子是完全和你所发的序列是一样的，就是有那么一些分子是有差错的，所以这种不同正巧出现在你的两次PCR中，其实即使是同一次PCR的不同克隆也很有可能会出现这种情况，原因就在于那一管引物粉末中不是所有的引物分子都是完全忠实于你所发的引物序列。 请LZ仔细分析下你的问题会不会是这种情况。如果是这样的话，必须重新设计更下游的引物来得到这一段的真实序列，因为拿这一段来设计引物测序得到的都只能是引物自己的序列。 |
6楼2013-02-01 23:16:25
chiden
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-02-01 21:13:08
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-02-01 21:13:08
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在此想请问一个问题，楼主在扩增这个相关基因时设计的引物是刚好从起始密码子或终止密码子设计的？ 在我们实验室，一般认为测序结果中前面80-100bp的测序结果是不准确的。不知道楼主那里的测序是不是从第一个碱基到最后一个碱基都保证是准确的？ 遇到这样的问题，应该先去查一查测序结果中的ABI文件中碱基读取峰图。 看楼主上面说的似乎没有查证过。 如果峰型很好，说明测序公司给你的测序结果是准确的。 那么考虑是否真的发生了突变？ 一般来说590bp一个反应足够了 还有要考虑的是PCR扩增的过程中是有一定的几率错配的 希望能帮到楼主吧，知道的也就这么多啦。。。 |
2楼2013-02-01 20:15:50
3楼2013-02-01 21:51:24
4楼2013-02-01 22:03:43
