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lixilei1314

金虫 (小有名气)

[交流] 相对定量内参基因的Ct值

1，请教各位，我最近在做荧光定量，一直在纠结一个问题。就是要不要调整mRNA的初始浓度，让最终荧光定量结果的内参基因Actin的Ct值在各个组织中相差不大（貌似最好小于1个循环）？理论上应该是各个组织中Actin的Ct值时相似的吧。
2，小弟都已经做完了，当时没考虑这个问题，做出来的结果，发现Actin的Ct值在各个组织中差异挺大的，最大都到5个循环左右了。现在才又考虑到这个问题了。纠结死了。这样的结果可能会有一定的影响，但还能用不？
请各位不吝赐教！
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1楼 2012-07-27 12:50:23
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vickie20

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
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lixilei1314: 金币+2, 好的，谢谢。 2012-07-30 09:00:40
有的人说，RNA最好调一致再做定量，有的说反正做的是相对定量不需要调，这个……我也在纠结中。不过我老师让我把RNA调一致了再做。还有一个说法是，单个内参在各组织各时期并不是总是很稳定，所以要用两个内参……
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2楼2012-07-28 10:43:35
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09丁于飞

银虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
lixilei1314: 金币+2 2012-08-21 17:06:02
如果是在国内发表文章，一般用一个内参就可以，内参在各个组有差异不会有什么影响。但是，若要在国外期刊发表需要做两个内参，并且这两个内参得到的最终结果不能差距太大。
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3楼2012-07-28 16:27:08
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decloud

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by vickie20 at 2012-07-27 14:43:35
有的人说，RNA最好调一致再做定量，有的说反正做的是相对定量不需要调，这个……我也在纠结中。不过我老师让我把RNA调一致了再做。还有一个说法是，单个内参在各组织各时期并不是总是很稳定，所以要用两个内参……

RNA怎么调一致啊，，我都是用nano测得浓度，然后用0.5ug逆转录，结果很悲催的，PCR内参ct差3，，，，
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4楼2012-07-30 13:37:11
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vickie20

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by decloud at 2012-07-30 13:37:11
RNA怎么调一致啊，，我都是用nano测得浓度，然后用0.5ug逆转录，结果很悲催的，PCR内参ct差3，，，，...

我先测下浓度，然后再跑胶调亮度，测OD我感觉不靠谱，还是跑胶比较靠谱
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5楼2012-07-30 15:21:02
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ice-bamboo

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问楼主最后是怎么解决这个问题的啊，多谢啦
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6楼2015-06-26 20:33:40
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ice-bamboo

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by decloud at 2012-07-30 13:37:11
RNA怎么调一致啊，，我都是用nano测得浓度，然后用0.5ug逆转录，结果很悲催的，PCR内参ct差3，，，，...

请问大侠是怎么解决内参不一致的问题的啊
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7楼2015-06-26 20:35:08
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空谈误国

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by vickie20 at 2012-07-28 10:43:35
有的人说，RNA最好调一致再做定量，有的说反正做的是相对定量不需要调，这个……我也在纠结中。不过我老师让我把RNA调一致了再做。还有一个说法是，单个内参在各组织各时期并不是总是很稳定，所以要用两个内参……

请问你是怎么调一致的？比如，反转录时RNA都用1ug，之后rt-pcr用的CDNA都用0.1ul这就是调一致了吗？
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8楼2015-08-10 10:18:25
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宫保鸡丁YZ

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不知道你是做什么物种的，我觉得你得找几篇外文文献，看看人家做的哪个内参在各个组织器官里表达相对稳定。不一定非要用Actin作为内参。另外，荧光定量PCR的话，我们都是在提好总RNA后，调整RNA的浓度一致，然后逆转录出cDNA,稀释到合理倍数后进行qPCR的。
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9楼2015-08-10 10:49:07
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