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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » nifH基因的定量PCR问题
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2013201621

铁虫 (初入文坛)

[求助] nifH基因的定量PCR问题 已有1人参与

最近在做土壤样品中nifH基因的荧光定量PCR，土壤样品为豆科植物的根际土，用的引物PolF/PolR,标曲：普通PCR扩出来后做克隆的单拷贝质粒，结果定量PCR标曲跑的不错，熔解曲线88度单一峰，但是悲催的是样品扩增曲线荧光值比标曲的都低很多，熔解曲线也没有单一峰，样品也梯度稀释跑了，稀释到100倍还是没有单一峰，有做过的小伙伴吗？请帮忙分析一下，求点播啊，附上扩增曲线、熔解曲线、标曲

nifH基因的定量PCR问题
扩增曲线.jpg


nifH基因的定量PCR问题-1
熔解曲线.jpg


nifH基因的定量PCR问题-2
标曲.jpg
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FIGHTING
1楼 2015-03-29 11:13:38
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懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+3, 鼓励热心应助！ 2015-03-31 10:48:27
先确认几点：标曲具体怎么做的？用polF/R扩增nifH，产物连到vector，再用vector上的primer扩增nifH还是仍用的polF/R？

样品是用polF/R扩的？

polF/R是简并引物？

melt curve中，比较做的较好的峰和出的不好的峰是用的同样的引物？
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向钱看，向厚赚
2楼2015-03-30 12:47:07
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2013201621

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 懒蛋 at 2015-03-30 12:47:07
先确认几点：标曲具体怎么做的？用polF/R扩增nifH，产物连到vector，再用vector上的primer扩增nifH还是仍用的polF/R？

样品是用polF/R扩的？

polF/R是简并引物？

melt curve中，比较做的较好的峰和出的不好 ...

感谢回复
标准质粒做好后，和样品同时跑，当然用的是nifH的引物。pol这对引物是简并引物，已有许多文献用这对引物做nifH的定量，说明引物的特异性、扩增效率是可以的。我现在的问题是为什么样品熔解曲线没有单一峰。另：定量的产物跑琼脂糖凝胶，发现样品的带很弱，并且有非特异性扩增，怀疑是样品nifH丰度低，然后循环数加到50还是这种情况，不知如何改善？
恕我直言，从回复中感觉你好像并不太熟悉绝对定量......也可能我帖子写的不够仔细让你误会了.......
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FIGHTING
3楼2015-03-30 16:00:43
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懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 2013201621 at 2015-03-30 16:00:43
感谢回复
标准质粒做好后，和样品同时跑，当然用的是nifH的引物。pol这对引物是简并引物，已有许多文献用这对引物做nifH的定量，说明引物的特异性、扩增效率是可以的。我现在的问题是为什么样品熔解曲线没有单一峰 ...

楼主够直接。你给biorad，lifetech，以及qiagen 技术支持打电话问这些问题，他们也会问你一些背景情况。你说他们熟不熟悉？如此凶悍的妹子，本人还是不作答了。

附：我做绝对定量和相对定量三年。可能还没有彻底掌握好吧，恕本人愚昧~

有趣的是，你跑胶都知道有非特异性扩增了，还用怀疑不出单一峰么？且是你第二个峰都是在expected peak之前，是不是可以怀疑一下primer dimer？为什么会出dimer？你也说了可能nifH丰度太低，那是不是引物浓度相对过剩了？
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向钱看，向厚赚
4楼2015-03-31 05:46:25
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懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)
还是说通过其他方法去掉这个第二峰？请楼主动动脑筋。
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向钱看，向厚赚
5楼2015-03-31 05:50:20
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bear0329

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 懒蛋 at 2015-03-31 05:46:25
楼主够直接。你给biorad，lifetech，以及qiagen 技术支持打电话问这些问题，他们也会问你一些背景情况。你说他们熟不熟悉？如此凶悍的妹子，本人还是不作答了。

附：我做绝对定量和相对定量三年。可能还没有彻底 ...

恩，资深
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以马内利！
6楼2015-04-01 08:29:55
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懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bear0329 at 2015-04-01 08:29:55
恩，资深...

熊大，解题！
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向钱看，向厚赚
7楼2015-04-01 08:50:10
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2013201621

铁虫 (初入文坛)
对大多数样品来说第一个峰大约在83度，这不太可能是引物二聚，应该是非特异性扩增，已经考虑换用化学修饰型热启动酶做......
此外，还想说，之前说的有些直接，表示抱歉。凶悍，第一次被人用这个词说，也是醉了...
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FIGHTING
8楼2015-04-02 16:51:50
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一路啸歌

新虫 (初入文坛)
请问楼主用pol F和pol R扩增nif H基因的PCR反应条件是什么？特别是退火温度，我扩了几次都没有任何条带，正在努力寻找原因，特此请求帮助~O(∩_∩)O谢谢了~
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9楼2015-05-04 10:02:22
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weishenmene

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 一路啸歌 at 2015-05-04 10:02:22
请问楼主用pol F和pol R扩增nif H基因的PCR反应条件是什么？特别是退火温度，我扩了几次都没有任何条带，正在努力寻找原因，特此请求帮助~O(∩_∩)O谢谢了~

请问你现在做出来没有？
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10楼2015-12-17 08:59:57
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