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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助，QRT PCR 用不同内参结果差距很大
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夜雨听风

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，QRT PCR 用不同内参结果差距很大 已有1人参与

RT，第一次做QRTPCR，转入P53 SHRNA 的和NON-TARGET SHRNA的对比，都取的1UG的RNA逆转录的，CDNA稀释一倍以后上机PCR的，做了3个重复孔，平行性挺好的相差0.5以内，溶解曲线也都是单峰应该没有引物二聚体，选了两个内参基因ACTIN 和GADPH，按两种内参最后算出来敲除效率一个百分之90多，一个百分之8。。。这是CT值的数据我都三个重复孔平均了的
        CONTROL        转入SHRNA
P53        25.88        28.43
ACTIN        23.26        22.04
GADPH        21.55        23.98
为什么我同样1UG的RNA反转，内参的CT值查那么多，难道真的这俩基因在对照和实验组里表达差距很大吗，我看文献里敲P53都有拿这俩基因当内参啊啊，纠结死了，应该考虑我是哪一步有问题啊希望大神指点指点，跪谢啊
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1楼 2015-04-14 22:51:55
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夜雨听风

新虫 (初入文坛)
就算是扩增效率不一样，结果也不会差这么多吧，扩增效率真的能跟1差很多么
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2楼2015-04-14 22:58:46
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夜雨听风

新虫 (初入文坛)
求指点啊
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3楼2015-04-16 15:31:50
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墨尔本机器

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-17 10:49:16
内参选择上本来就很难有定论，目前来说最可靠的是对坐几对内参，对比下更倾向于哪种趋势。也可以提高数据可信度，认可度较高。楼主再来一个18S、EFA...吧
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4楼2015-04-16 18:42:23
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by小宁

木虫 (初入文坛)
楼主的问题解决了么？我的内参引物一个真菌野生型样品中是20 另一个真菌诱变型样品中是25  这种可以用么？
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5楼2015-07-16 19:05:28
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