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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR弥散带问题
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一苇渡江.hr

新虫 (初入文坛)

[求助] RT-PCR弥散带问题

请教各位一下啊，做RT-PCR时，条带从点样孔一直拖下来，可能的原因是什么啊？再就是能够扩出非目的基因条带，但就是扩不出目的基因的带，是不是说明cDNA是没问题的，问题在设计的引物上啊？急，谢谢啊！
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1楼 2012-02-17 17:50:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xiaoke2046

木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

西瓜(金币+1): 鼓励应助 2012-02-19 18:42:57
有内参，还扩不出来，个人认为最大的问题是引物设计不当
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6楼2012-02-19 11:27:20
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普通回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一苇渡江.hr(金币+1): 2012-02-25 02:54:04
楼主的模板稀释过吗？是不是模板浓度过大？
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jiayoubashaonian
2楼2012-02-17 20:14:50
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一苇渡江.hr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-02-17 20:14:50:
楼主的模板稀释过吗？是不是模板浓度过大？

他们也说可能是这个原因，谢谢提醒啊，正准备做一个模板的梯度，明天看看能不能跑出结果来。
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3楼2012-02-18 04:03:18
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xiaoke2046

木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励 2012-02-19 18:42:46
验证是不是模板问题，可以用内参试一下
内参可以，模板应该就没问题
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4楼2012-02-18 09:14:10
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一苇渡江.hr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by xiaoke2046 at 2012-02-18 09:14:10:
验证是不是模板问题，可以用内参试一下
内参可以，模板应该就没问题

就是之前有时候能跑出内参，也扩不出来基因啊，我要的是全长的，不好扩。好的，谢谢，我试试看。。。
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5楼2012-02-19 03:47:02
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yanbofeiyue

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
请问你解决了吗？我做RT-PCR的时候，也是好多条带，而且条带特别暗，退火温度优化过了，不解？
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justdoit!whateverotherssay!
7楼2012-02-20 20:07:45
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一苇渡江.hr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-02-17 20:14:50:
楼主的模板稀释过吗？是不是模板浓度过大？

跑了一个模板浓度梯度，短片段能扩出来，长的还是不行，不会是是mlv到不了5‘端，模板不完整吧
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8楼2012-02-21 04:20:21
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一苇渡江.hr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by xiaoke2046 at 2012-02-19 11:27:20:
有内参，还扩不出来，个人认为最大的问题是引物设计不当

刚刚能把目的基因的比较中间的片段扩出来，不知道是不是引物太靠近5’端了，反转录时用的oligo dt ，mlv到不了5’端。我的mRNA模板长2600左右。已经重新设计了几条引物，再试试。 3q
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9楼2012-02-21 04:24:51
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一苇渡江.hr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by yanbofeiyue at 2012-02-20 20:07:45:
请问你解决了吗？我做RT-PCR的时候，也是好多条带，而且条带特别暗，退火温度优化过了，不解？

可能是引物的问题，是不是引物特异性不强，可以在线做个比对试试
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10楼2012-02-21 04:27:57
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