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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR扩不出目的基因
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gloryping

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] PCR扩不出目的基因

从细胞中抽提RNA，然后反转录为cDNA，在做定量PCR前先做普通PCR，可是扩了好几次都没扩出来，跟文献用的是同样的引物，PCR反应条件也是参考文献中的，使用了genomic DNA 作为内参，但最终是只有引物二聚体，扩不出目的条带。不知RNA及后续cDNA质量会不会影响PCR，本人是新手，求指教！
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1楼 2011-09-18 17:08:55
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

依依米米

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gloryping(金币+2): 2011-09-18 17:26:12
lstt09nk(金币+2): 热心虫友 2011-10-11 14:33:02
做不出来有很多原因的，但鉴于你是新手，我个人觉得是不是有些东西加多了，比如酶一般25u的体系加0.5就很多了，但如果你把枪头完全插进去，壁上沾的就不仅仅0.5了，慢慢来，多试几遍，一定要小心谨慎。生物114 http://www.shengwu114.com/
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2楼2011-09-18 17:24:40
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hgq115

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

gloryping(金币+2): 2011-09-19 12:36:22
你参照的文献是什么杂志的，还是建议自己设计一次引物，因为很多中文文献上的引物，直接用来做都很难做出来，我曾经就出过这样的问题。
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4楼2011-09-19 09:51:51
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gloryping

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zhangjing202 at 2011-10-11 10:51:28:
有时候dNTP加多了也P不出来的，建议检查一下体系是否合适

恩恩，现在已经做出来了，就是存在非特异，PCR这东西需要捣鼓的方面太多了，呵呵
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11楼2011-10-11 11:06:05
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普通回帖

gloryping

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 依依米米 at 2011-09-18 17:24:40:
做不出来有很多原因的，但鉴于你是新手，我个人觉得是不是有些东西加多了，比如酶一般25u的体系加0.5就很多了，但如果你把枪头完全插进去，壁上沾的就不仅仅0.5了，慢慢来，多试几遍，一定要小心谨慎。生物114 [u ...

谢谢解答。酶加多了也会扩不出来吗？
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3楼2011-09-18 17:26:57
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清风寨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

gloryping(金币+2): 2011-09-19 12:39:21
建议自己设计引物 不要所有都参照文献 退火温度可以设置梯度试一下  延伸时间要充足 等等 有时候自己做PCR时同样条件就有时能出来有时出不来 很是郁闷
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冷风过心变热
5楼2011-09-19 11:09:38
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anhong1122

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

gloryping(金币+2): 2011-09-19 12:40:03
是不是引物或者PCR条件的问题，可以优化一下PCR条件啊
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努力创造新生活
6楼2011-09-19 11:26:21
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gloryping

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hgq115 at 2011-09-19 09:51:51:
你参照的文献是什么杂志的，还是建议自己设计一次引物，因为很多中文文献上的引物，直接用来做都很难做出来，我曾经就出过这样的问题。

参考文献的杂志是the journal of biological chemistry.要扩增的基因序列我也查到了，证实引物序列没错。应该还是我的PCR体系有问题，还是一步一步优化条件吧，真难啊
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7楼2011-09-19 12:39:07
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gloryping

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 清风寨 at 2011-09-19 11:09:38:
建议自己设计引物 不要所有都参照文献 退火温度可以设置梯度试一下  延伸时间要充足 等等 有时候自己做PCR时同样条件就有时能出来有时出不来 很是郁闷

(⊙v⊙)嗯  下一步就准备这样做，谢谢您的建议
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8楼2011-09-19 12:39:55
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gloryping

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by anhong1122 at 2011-09-19 11:26:21:
是不是引物或者PCR条件的问题，可以优化一下PCR条件啊

引物应该没问题，PCR条件出问题的可能性大，这个PCR还真是麻烦啊
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9楼2011-09-19 12:40:43
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zhangjing202

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

gloryping(金币+2): 2011-10-11 11:05:28
有时候dNTP加多了也P不出来的，建议检查一下体系是否合适
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只要出发，就能到达
10楼2011-10-11 10:51:28
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