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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR的结果只有引物二聚体出来，目的片段没有。换过很多条件。求大神指导
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夏木鲁鲁

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR的结果只有引物二聚体出来，目的片段没有。换过很多条件。求大神指导 已有9人参与

做的是金银花ITS2序列
体系 总25ul
mix 12.5ul
引物1 1ul
引物2 1ul
双蒸水 7.5ul
模板    3ul

下面是两个引物的条带。不过可能图倒了
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夏木鲁鲁

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1楼 2016-01-13 19:36:26
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反应链

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-13 22:51:07
I think you should use a positive control, such as amplification of  housekeeping gene (Actin, etc.), which really does much help for troubleshooting.

Therefore, you should amplify a housekeeping gene using your DNA samples tomorrow.
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5楼2016-01-13 20:02:14
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夏木鲁鲁

新虫 (初入文坛)
除了58c退火以外。56 59  60  都做了。效果差不多。
体系模板2ul  3ul  4ul  5ul   都做了。结果没有什么变化
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3楼2016-01-13 19:45:34
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chiemo

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你怎么判定是引物二聚体的？是否因为合成的引物不纯？可以试试touchdown PCR，我之前跑出来有杂带，touchdown后就只有目标序列了
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6楼2016-01-14 10:48:41
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Ciruela

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模版降解、引物不对，有可能的
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7楼2016-01-14 13:25:34
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匿名

用户注销 (小有名气)
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8楼2016-01-14 13:35:14
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分子2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用actin检测模板，看模板是不是有问题。如果没有问题就降低模板的量，1-2ul，56度在试试。如果还是不行就是引物的问题
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科研是条不归路！
10楼2016-01-14 14:41:36
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ss2032

木虫 (正式写手)

咸鱼
引用回帖:
2楼: Originally posted by 夏木鲁鲁 at 2016-01-13 19:42:41
因为传图好像有限制。大家将就看(⊙o⊙)。
反应条件。预变性94c。  5min
                      变性94c。  30s
                      退火58c      30s
                      延伸72c       45s
共40个循环 ...

一般不是做30个循环么？？？
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努力翻身
11楼2016-01-14 14:52:09
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普通回帖

夏木鲁鲁

新虫 (初入文坛)
因为传图好像有限制。大家将就看(⊙o⊙)。
反应条件。预变性94c。  5min
                      变性94c。  30s
                      退火58c      30s
                      延伸72c       45s
共40个循环
                      最后延伸72c   10min
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2楼2016-01-13 19:42:41
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金木研么么哒

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没有条带的话就降温，试试56，55，54，53，52

发自小木虫Android客户端
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4楼2016-01-13 19:51:12
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边木殇

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以设置阳性对照，适当降低退火温度，检查模板
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9楼2016-01-14 14:17:18
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