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lingling1988铜虫 (初入文坛)
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小目的片段的测序及设计引物的疑问
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| 我要对回收到的一些目的片段进行测序，目前出现的问题：一，这些目的片段中有的本来应该在800-1000bp之间不等，可是再用相应的引物并以它们为模板做PCR，在琼脂糖凝胶上检测的结果却只有250-500bp之间；其二，就是有些片段本身很小，100-500bp，PCR检测的结果也与其对应，但是我的疑问是对于这么小的目的片段，想拿去测序的话，在连接、转化、质粒检测等方面应该注意哪些细节，以及在设计引物时要注意什么问题？ |
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lingling1988(wizardfan代发): 金币+4, 谢谢分享经验 2013-09-17 06:30:33
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| 其他的应该没有太大问题，按一般情况做就好，就是小片段跑胶的时候需要浓度高点的胶，不然和你引物二聚体分不开。我要说的是连接问题，个人觉得300bp以上的连接都没问题，但100bp的话有点小，连接的时候可以适当延长时间，如果T-A连接可能还好，但如果是酶切后连接可以在连接前将载体和PCR产物在65°加热5 min，然后再连接！Good luck！ |
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lingling1988
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