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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌落PCR
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呀薯条

金虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR 已有7人参与

我在做目的基因与载体的连接，自己做的感受态，做完连接后涂布与含有氨苄的平板，做了四五次，只有两次平板有菌落长出，挑取单菌落，进行菌落PCR，可是一直没有结果（电泳条带只有200bp左右），这是什么原因啊？
       那个平板在冰箱中放了四五天了，我可以继续再挑取单菌落，重新进行次菌落PCR吗？一直PCR没有结果的原因会不会是自己的目的基因扩增所用的引物与载体上某一部位连接起来了啊？
     我快要纠结死了，求指导！
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1楼 2014-04-14 17:11:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
呀薯条(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-14 17:38:00
可以的，要多挑几个，你自己做的感受态可能转化率较低。
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学习使你立于不败之地
2楼2014-04-14 17:28:26
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普通回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有没有假阳性率高的可能

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-04-14 18:19:37
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呀薯条

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-04-14 17:28:26
可以的，要多挑几个，你自己做的感受态可能转化率较低。

PCR只有200bp左右，说是载体自连，会不会是我的引物与载体形成互补序列，从而导致pcr不能做出来啊？
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4楼2014-04-14 20:20:35
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
除了确保你的基因和载体同时都切开的情况下，连接体系的比例也是很关键的
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天道酬勤
5楼2014-04-14 20:52:11
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yuren2009

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 呀薯条 at 2014-04-14 20:20:35
PCR只有200bp左右，说是载体自连，会不会是我的引物与载体形成互补序列，从而导致pcr不能做出来啊？...

菌液PCR前你不是用蓝白斑筛选？P不出来很可能没有连接成功。
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学习使你立于不败之地
6楼2014-04-14 21:06:33
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
200bp估计是载体自连，你再换对引物试试，别是单引物出的带。
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hehe
7楼2014-04-14 21:20:54
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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呀薯条: 金币+1, ★有帮助 2014-04-15 09:43:12
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-04-15 12:06:01
首先怀疑你感受态效率
第二你只有两次转化做出来了，到底长了几个斑？要是没几个的话，建议买个商用的感受态试试
你的菌落pcr的引物是设计在载体两端还是设计在你的目的基因上面？你自己完全可以判断是不是连接上去了，你什么都不说，大家在这里瞎猜是什么自连啊之类的，不是浪费你时间吗？
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8楼2014-04-15 08:31:21
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
呀薯条: 金币+1, ★有帮助 2014-04-15 09:43:23
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-15 12:06:08
可能是假阳性克隆，如果单克隆不多的情况下这种可能性更大。建议有两种选择：1、做一下对照，看看不长是什么原因（连接？转化？感受态？）2、是不是pcr忘记加什么东西或者是温度程序设计的不合理，还有一种方法就是提取质粒，双酶切检测一下。
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9楼2014-04-15 09:06:25
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呀薯条

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by grape_vine at 2014-04-15 08:31:21
首先怀疑你感受态效率
第二你只有两次转化做出来了，到底长了几个斑？要是没几个的话，建议买个商用的感受态试试
你的菌落pcr的引物是设计在载体两端还是设计在你的目的基因上面？你自己完全可以判断是不是连接上 ...

那两次板上长得挺多的呢，一次菌落比较小，一次是菌落挺大的。
我的引物设计就用的当初目的基因扩增的引物，两头都有个酶切位点
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10楼2014-04-15 09:41:33
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