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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR的结果只有引物二聚体出来，目的片段没有。换过很多条件。求大神指导
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ss2032

木虫 (正式写手)

咸鱼
引用回帖:
2楼: Originally posted by 夏木鲁鲁 at 2016-01-13 19:42:41
因为传图好像有限制。大家将就看(⊙o⊙)。
反应条件。预变性94c。  5min
                      变性94c。  30s
                      退火58c      30s
                      延伸72c       45s
共40个循环 ...

一般不是做30个循环么？？？
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努力翻身
11楼2016-01-14 14:52:09
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狗狗狗尾巴草

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模版浓度不是越高越好的，如果模版DNA里面有抑制剂什么的，会抑制PCR的反应，楼主可以考虑降低模版量试试。另外最好有阳性对照，如果阳性对照都P不出来的话，可以考虑换试剂
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12楼2016-01-14 15:23:18
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快乐的生科妹

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
那个mix是缓冲液的意思吗?请问加的是哪种DNA聚合酶呢？
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13楼2016-01-16 00:06:15
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万法唯心

新虫 (小有名气)
感觉模板加多了，加个2ul试试，退火温度试试52度和55度，另外，你目的片段多大，延伸时间是否够呢

发自小木虫Android客户端
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14楼2016-01-16 07:07:15
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pengc201

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
15楼2016-01-17 01:03:56
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books

木虫 (小有名气)
可以问我，我最近也做这个，刚做出来，私聊。
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16楼2016-01-18 16:56:21
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2012continue

新虫 (小有名气)
对PCR各环节都优化了还不能解决问题，就重新设计引物把，也许引物和基因组DNA配对不佳。
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17楼2016-01-18 21:32:59
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夏木鲁鲁

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-13 20:02:14
I think you should use a positive control, such as amplification of  housekeeping gene (Actin, etc.), which really does much help for troubleshooting.

Therefore, you should amplify a housekeeping ...

谢大神。今年放假，现在已经不做了。等来年去学校再试
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18楼2016-01-21 11:46:35
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夏木鲁鲁

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by chiemo at 2016-01-14 10:48:41
你怎么判定是引物二聚体的？是否因为合成的引物不纯？可以试试touchdown PCR，我之前跑出来有杂带，touchdown后就只有目标序列了

是这样。我的目的片段大概是300bp。出来的是50bp左右。可能是引物二聚体或者非特异性扩增。我刚接触这一块，还有很多东西要学。多谢，多谢。
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19楼2016-01-21 11:49:16
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夏木鲁鲁

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by noicecoola at 2016-01-14 13:35:14
先检测一下你的模板吧，排除了模板以后。再测一下你模板的浓度吧。然后按mix的说明书把引物与模板量搭配好。

多谢指点。我想可能也有这方面的问题。等来年我回学校再试试
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20楼2016-01-21 11:51:53
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